洛美利嗪对糖尿病大鼠早期视网膜神经节细胞的保护作用

摘要

糖尿病(diabetes mellitus，DM)的临床和实验研究结果显示在未出现视网膜微血管病理改变之前，就有神经视网膜的损伤，继而出现视网膜功能改变。视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells，RGCs)是视网膜唯一的视觉信息输出元件，研究在糖尿病早期对它的保护尤显重要。洛美利嗪(lomerizine，LOM)一种新型钙离子阻断剂，可以通过减少钙离子(Ca2+)内流，改善眼内微循环，从而起到神经保护作用。本研究的目的是观察LOM对糖尿病早期RGCs的保护作用，为防治糖尿病早期视网膜神经损伤提供实验依据。
　　 材料与方法
　　 成年雄性Spraque—Dawley(SD)大鼠90只，体重210～250g左右，应用随机数字表发将大鼠分为对照组(CON)、糖尿病组(DM)、洛美利嗪组(LOM)。采用链脲佐菌素(STZ)按60mg/kg一次性腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。在糖尿病大鼠模型建立2天后，LOM组每日予LOM60mg/kg体重灌胃，CON组和DM组采用等量生理盐水灌胃。第4、8、12周时各组分别行HE、TUNEL检测、透射电镜和激光共聚焦显微镜检测，用OLYMPUS FLUOVIEW3.1aViewer软件进行钙离子浓度染色分析。应用SPSS12.0统计分析软件，统计学处理采用方差分析方法。P＜0.05视为有统计学差异。
　　 实验结果
　　 1、形态学观察:随病程延长，逐渐出现RGCs数量减少、细胞排列紊乱的病理改变。透射电镜下可见DM组RGCs出现不同阶段的凋亡征象，且随病程延长逐渐加重。LOM组与同期DM组对比，第8、12周时RGCs凋亡征象减弱。
　　 2、TUNEL检测:CON组大鼠视网膜神经节细胞层未见凋亡细胞。DM组4周时视网膜神经节细胞层偶见TUNEL阳性细胞，并随病程延长逐渐增多，凋亡指数与同期CON组比较明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。LOM8w组和12w组，与同期DM组比较，染色阳性的RGCs明显减少，凋亡指数明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　 3、激光共聚焦显微镜钙离子浓度检测:DM组与同期CON组比较: DM组8、12w的RGCs内Ca2+荧光染色强度明显升高，有显著差异（P＜0.01）。LOM组与同期DM组比较:LOM组8、12w的RGCs内Ca2+荧光染色强度明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　 讨论
　　 糖尿病早期未出现视网膜微血管病理改变之前，就有神经视网膜的损伤，继而出现视网膜功能改变。视网膜神经成分损害的现象逐渐引起重视，RGCs是视网膜唯一的视觉信息输出元件，研究在糖尿病早期对其保护显得尤为重要。
　　 本实验证实了在糖尿病早期RGCs就已经发生了损伤和凋亡，进一步发展就会导致功能上的改变，早期对RGCs的保护显得非常重要。本实验结果显示:DM组4周时RGCs内钙离子浓度开始升高，且随病程延长逐渐加重。其发生的机制可能是:(1)谷氨酸神经毒性作用。糖尿病视网膜病变时，由于发生代谢的异常，导致谷氨酸浓度升高，过多的谷氨酸通过N-甲基-D-天（门）冬氨酸(NMDA)受体的作用，导致钙内流增加，细胞内Ca2+浓度升高;(2)谷氨酸受体钙通道可以促进电压门控性钙通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)去极化，进一步增加Ca2+内流。
　　 本实验结果证明了LOM通过抑制RGCs钙离子的内流、减轻钙超载，对细胞起到了保护作用。其原因可能为:(1) LOM可以扩张血管，改善眼内微循环;(2)LOM通过减少Ca2+内流，拮抗谷氨酸引起的兴奋毒性;(3) LOM是L型和T型电压依赖性钙通道的阻断剂，通过阻断由电压依赖性钙通道引起的Ca2+内流，从而减轻Ca2+超载，到达保护视网膜神经细胞的作用;(4) LOM减少磷酸酶的表达、减少氧化应激反应，并且早期可以增加巨噬细胞的数量;(5) LOM影响caspase-3的表达。
　　 结论：
　　 1、糖尿病大鼠早期RGCs出现了凋亡。
　　 2、糖尿病大鼠早期RGCs凋亡的机制之一是细胞内钙离子内流增多和钙离子浓度的升高。
　　 3、LOM对糖尿病大鼠早期RGCs的凋亡具有保护作用。

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