接触脑脊液神经元参与疼痛机制的研究

摘要

目的：
　　 接触脑脊液神经元(cerebrospinal fluild-contacting neurons，CSF-CNs)，简称触液神经元，是位于脑实质内的一种特殊类型的神经元。其特殊之处在于它的胞体位于脑实质，而突起却伸入脑脊液中。我们以往的研究证实，该类神经元在脑实质的大多数部位只有零星散在分布，而在中脑与脑桥交界处毗邻中脑导水管周围灰质(PAG)和中缝背核(DR)的脑组织中，却恒定存在着一个触液神经元高度集中、境界分明的神经核团，我们首次在国际上将其命名为接触脑脊液神经核(CSF-contacting nucleus，CSF-CN)，简称触液核。基于它的特殊的位置关系，一方面能通过脑-脊髓-外、周神经的途径参与机体的功能调控，另一方面也可以通过脑-脑脊液途径在机体功能调控中发挥重要作用。因此有可能在机体神经、体液两大功能调节中扮演着不可或缺的重要角色，但其确切的生物学功能并不完全清楚。
　　 自发现这一核团以来的过去20年中，我们围绕触液核与疼痛传导、调制关系已经进行了一系列整体研究，先后证实在不同疼痛条件下，触液核的c-Fos、GABA、5-HT及其受体、TRPM8和ERK等10余种神经活性物质（递质、受体、离子通道等）可以发生表达的变化，且与疼痛的行为和强度具有时相的相关性。然而整体研究因受到机体调控作用的影响而难以凸显触液核本身的生物学特点。对于触液核参与生命活动的细胞与分子机制研究，如能排除整体调节因素的影响，相对独立地观察触液神经元中相关物质的表达与调控则更为科学可靠。因此本研究创新性地将触液核进行原代培养，在相对统一、便于操控的离体实验条件下研究其在疼痛中的具体作用机制。
　　 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酸敏感离子通道蛋白3(acid-sensing ionchannel3，ASIC3)和P物质(substance P，SP)均与疼痛关系密切。ASIC3是对pH值改变最敏感的酸受体，与炎性痛、神经病理性痛等多种痛觉有关。PKC是 ASIC3在疼痛中发挥作用的重要上游调节途径。SP是疼痛信号传递的经典递质，是ASIC3参与疼痛传递的下游信号分子。那么在触液神经元中是否存在PKC-ASIC3-SP信号通路？此信号通路在触液神经元参与的疼痛中发挥着怎样的作用？具体机制为何？尚未见报道。
　　 综上所述，本研究将在体研究与离体研究相结合，从整体、细胞、分子水平阐明触液神经元中PKC-ASIC3-SP信号通路的激活与调控在疼痛中的作用。本研究成果将揭示触液神经元参与疼痛的细胞与分子机制，丰富研究触液神经元的方法学，为临床疼痛性疾病的治疗提供新的思路。
　　 材料与方法
　　 一、触液神经元的离体培养与鉴定
　　 （一）实验动物1、雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠SPF级(250-280g)，所有实验均得到徐州医学院实验动物伦理委员会的许可。
　　 2、雌性SD大鼠SPF级，孕18天，所有实验均得到徐州医学院实验动物伦理委员会的许可。
　　 （二）实验分组A组（侧脑室注射CB-HRP），B组（侧脑室注射CB），C组(侧脑室注射CB-FITC)，D组（脑实质触液核旁注射CB-FITC）:(n=6)。
　　 （三）侧脑室注射标记触液核大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后固定至动物立体定位仪。立体定位（Bregma:-1.2±0.4 mm,Depth:3.2±0.4 mm,Right to median sagittal plane:1.4±0.2mm），侧脑室注射上述各分组药物各3μl，动物静养48h后灌注、固定、取材，免疫荧光技术标记触液核，CB-FITC组无需免疫反应过程。
　　 （四）核团注射标记触液核大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后固定至动物立体定位仪。立体定位(Bregma:-8.2±0.2 mm, Depth:7.0±0.4 mm, Right to median sagittal plane:0.2±0.1 mm)，脑实质触液核注射CB-FITC1μl，动物静养48h后灌注、固定、取材，组织按正常程序处理后无需免疫反应过程直接在共聚焦显微镜下观察触液核荧光标记情况。
　　 （五）组织免疫荧光染色深麻醉、灌注取材后固定，蔗糖脱水，冰冻切片、免疫荧光双标、激光共聚焦显微镜下观察CB-HRP和CB对触液核的标记情况。CB-FITC标记组无需传统的免疫反应过程，切片后直接贴片用共聚焦显微镜观察标价触液核效果。
　　 （六）触液神经元的原代培养将怀孕18天SD大鼠胚胎取出，按照触液核定位选取组织。剪碎-消化-离心-吹打-过滤，以0.5-1.0×105/cm2的密度接种于预处理（采用D-多聚赖氨酸）的培养瓶或24孔培养板（内置直径1 cm的盖玻片），参照一般中枢神经元原代培养方法进行培养。
　　 （七）DAPI荧光染色将生长于24孔培养板的触液神经元，用DAPI染细胞核，在OlympusVanox荧光显微镜上观察。
　　 （八）CB-FITC标记原代培养的触液神经元将CB-FITC于实验前24h作用于细胞，无需传统的免疫反应过程，可直接用于离体触液神经元鉴定、形态观察、递质检测等。
　　 （九）统计学处理计量资料以mean±SEM表示;用GraphPad Prism5.0软件(GraphPad Software，USA)进行统计学分析(one-way ANOVA followed by a post hoc Tukey test)及作图，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 二、离体触液神经元疼痛模型的构建及痛相关递质表达检测（一）实验动物SPF级，雌性孕18天SD大鼠，由徐州医学院实验动物中心提供。
　　 （二）实验分组将接种于24孔培养板的细胞，分为A-E五组，每组又分为正常生长组和疼痛组(n=6)。通过免疫荧光双标检测各组递质表达情况，用ELISA分别检测各组细胞在疼痛状态下与正常生长状态下递质表达量并作出比较。
　　 A组:5-HT表达情况;
　　 B组:GABA表达情况;
　　 C组: ERK表达情况;
　　 D组:c-Fos表达情况;
　　 E组:TRPM8表达情况。
　　 （三）触液神经元的原代培养同前。
　　 （四）触液神经元细胞疼痛模型的建立用100μM的dmPGE2刺激离体培养的触液神经元细胞诱导疼痛发生。
　　 （五）细胞免疫荧光双标染色实验前24h在培养基中加入CB-FITC标记触液神经元，待测递质免疫反应过程为:漂洗细胞-室温固定-透化处理-封闭-一抗过夜-红色二抗-终止反应-封片，于荧光显微镜上观察。
　　 （六）酶联免疫吸附法(ELISA)检测递质表达ELISA测定各组递质表达。按试剂盒说明书完成实验步骤，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定在加终止液后5分钟以内进行。
　　 （七）统计学处理计量资料以mean±SEM表示;用GraphPad Prism5.0软件(GraphPad Software，USA)进行统计学分析（ANOVA）及作图，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 三、触液神经元PKC-ASIC3-SP信号通路在疼痛中的激活与调控（一）实验动物1、雄性SD大鼠SPF级，250-280g，由徐州医学院实验动物中心提供。
　　 2、雌性SD大鼠SPF级，孕18天，由徐州医学院实验动物中心提供。
　　 （二）实验分组1、在体研究SD雄性大鼠随机分为A、B、C三组(n=6)。用完全弗氏佐剂(CFA)制作炎性痛模型，对照组用同样注射方法相等剂量注射PBS，观察物质表达变化与动物疼痛行为的相关性。
　　 A组:PKC组，再分为对照组、抑制剂组、模型组和模型组+抑制剂组;
　　 B组:ASIC3组，再分为对照组、抑制剂组、模型组和模型组+抑制剂组;
　　 C组:SP组，再分为对照组、抑制剂组、模型组和模型组+抑制剂组。
　　 2、离体研究
　　 原代培养的触液神经元接种于25cm2培养瓶中，随机分为A、B、C三组(n=6)，疼痛模型组dmPGE2诱导疼痛后，分别检测PKC、ASIC3和SP活化峰值时间点，通过抑制剂的给予观察各物质之间的调控作用。
　　 A组:PKC组，再分为对照组、抑制剂组、模型组和模型组+抑制剂组;
　　 B组:ASIC3组，再分为对照组、抑制剂组、模型组和模型组+抑制剂组;
　　 C组:SP组，再分为对照组、抑制剂组、模型组和模型组+抑制剂组。
　　 （三）触液神经元的原代培养同前。
　　 （四）细胞疼痛模型制作同前。
　　 （五）大鼠炎性痛模型制做大鼠左侧足底皮下注射CFA100μl，建立炎性痛模型。CFA足底注射后产生典型的外周炎症表现包括:注射部位局部的红、肿、疼痛等，持续时间大于一周。
　　 对照组:大鼠左侧足底皮下注射PBS100μl。
　　 （六）组织免疫荧光双标雄性SD大鼠侧脑室注射CB-FITC48h后深麻醉、灌注取材后固定，蔗糖脱水，冰冻切片、加p-PKC、ASIC3和SP一抗孵育，红色二抗，激光共聚焦显微镜下分别观察CB-FITC（绿色）与p-PKC、ASIC3和SP阳性（红色）双标情况。
　　 （七）疼痛行为学观察分别在模型后15min、30min、45min、60min、75min和90min:采用热痛敏仪测定热缩足潜伏期(Thermal Withdrawal Latency，TWL)评估热痛敏。
　　 （八）物质表达定量检测1、酶联免疫吸附试验(ELISA)2、免疫印迹法（九）统计学处理用GraphPad Prism5.0软件(GraphPad Software，USA)进行统计学分析并生成统计图表。计量资料以mean±SEM表示。多个实验组之间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Tukey's post hoc test检验，热缩足潜伏期结果采用双因素方差分析(two-way ANOVA，时间为组内因素，处理为组间因素)。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 实验结果：
　　 一、触液神经元的离体培养与鉴定（一）CB-HRP、CB和CB-FITC对触液核标记效果比较经大鼠侧脑室注射分别给予CB-HRP、CB和CB-FITC，三者均可特异性地、科学可靠地标记触液核(n=6，P＞0.05)。
　　 （二）侧脑室与脑实质分别注射CB-FITC对触液核标记效果比较将CB-FITC分别注入侧脑室和触液核，两种不同标记途径对触液核的标记效果无差别(n=6，P＞0.05)。
　　 （三）触液神经元的原代培养与特异性标记原代培养的触液神经元生长7-10天左右发育成熟。用神经元细胞核抗体NeuN、DAPI与CB-FITC共同标记原代培养成熟的触液神经元，发现本培养条件下细胞中约有98％为神经元(NeuN标记阳性)，这其中有92％左右为触液神经元（CB-FITC标记阳性）。
　　 二、离体触液神经元疼痛模型的构建及痛相关递质检测原代培养的触液神经元在正常生长状态下和疼痛状态下均有5-HT、GABA、ERK、c-Fos和TRPM8表达，且各种递质在疼痛组表达量均明显高于正常生长组(n=6，P＜0.05)。
　　 三、触液神经元PKC-ASIC3-SP信号通路在疼痛中的激活与调控1、在体触液核PKC、ASIC3和SP表达检测SP、ASIC3和PKC在正常组大鼠和炎性痛组大鼠触液核均有表达，疼痛组触液核物质表达量均高于正常组（n=6，P＜0.05）。
　　 2、在体触液核PKC、ASIC3和SP表达变化与动物痛行为的相关性PKC、ASIC3和SP抑制剂能减少相应的物质表达并能上调炎性痛大鼠痛阈值(n=6，P＜0.05)。
　　 3、PKC、ASIC3和SP在离体触液神经元细胞疼痛模型中表达时间曲线PKC、ASIC3和SP在本实验细胞疼痛模型中表达高峰时间点一致，均出现在疼痛发生后6h，其后逐渐衰减（n=6，P＜0.05）。
　　 4、PKC、ASIC3和SP在细胞疼痛模型中的调控关系(1)给予ASIC3抑制剂后，ASIC3和SP表达水平均下降(n=6，P＜0.05)。
　　 (2)给予PKC的抑制剂后，PKC活化水平、ASIC3和SP表达水平均下降(n=6，P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1、将触液核部位的触液神经元进行原代培养，利用CB-FITC标记触液神经元活细胞，并在离体条件下构建触液神经元疼痛模型，是一种创新的、科学的研究手段，为深入研究触液神经元的生物学特征与功能奠定可靠的方法学基础;
　　 2、原代培养的触液神经元中有5-HT、GABA、ERK、c-Fos和TRPM8表达，且各种物质在疼痛组表达量均明显高于正常生长组，说明上述物质在触液神经元参与的疼痛中发挥了一定作用，这不仅是对本实验室在体研究的有力佐证，亦进一步证实了用离体触液神经元疼痛模型研究疼痛发生机制的可靠性和科学性;
　　 3、PKC-ASIC3-SP在触液神经元参与的疼痛过程中发挥了调制作用，具体表现为:疼痛组大鼠PKC、ASIC3和SP表达量显著高于正常组，通过抑制他们的表达能提高大鼠热痛阈值，减轻疼痛;PKC可通过抑制ASIC3的活化减少SP的释放。这是国内外首次从细胞与分子水平揭示触液神经元参与疼痛的具体机制，本研究成果将为临床防治疼痛提供新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 触液神经元的离体培养与鉴定

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 离体触液神经元疼痛模型的构建及痛相关递质表达检测

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 触液神经元PKC-ASIC3-SP信号通路在疼痛中的激活与调控

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

研究总结

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

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