间歇低氧对肝脏低密度脂蛋白受体相关蛋白1的作用及其机制研究

摘要

目的：
　　阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（Obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一种常见的睡眠呼吸紊乱性疾病，与高血压、冠心病、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的发生、发展关系密切，严重者可危及生命[1～3]。有研究证实，OSAS患者血脂谱异常，表现为甘油三脂（Triglycerides，TG）、总胆固醇(Total cholesterol，TC)、极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein，VLDL)、低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein，LDL)均明显升高，而高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)则降低，表明OSAS患者脂质代谢紊乱与其心血管疾病的发生有密切的关系[4-7]。
　　在OSAS患者中，由于夜间睡眠时反复出现呼吸停止，会导致低氧血症、高碳酸血症及睡眠质量低下，上述结果能引起呼吸、心血管、精神神经、血液、内分泌等多系统的病理生理变化。因此，睡眠中间歇低氧(Intermittent hypoxia，IH)是OSAS病理生理机制的关键。有动物实验表明，给予小鼠IH5天后，其血清TC、HDL及TG的水平增加，而4周之后LDL的水平亦增加[8,9]，且血脂升高的程度与低氧刺激的严重度呈正比[8]。因此，IH可能是OSAS患者高脂血症的直接原因。
　　低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Low density lipoprotein receptor-related protein1，LRP1)是一种内吞性的多功能受体，广泛分布于肝细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、神经细胞等，以肝实质细胞中含量最丰富。能识别多种配体并在体内清除之。LRP1首先与其配体结合成复合物并被内吞入细胞，形成内体，然后配体在溶酶体内水解，LRP1则再回到细胞膜循环使用。LRP1在肝细胞表面的主要作用是与载脂蛋白E和乳糜微粒残粒结合，LRP1还可以清除富含TG的脂蛋白残粒，比如乳糜微粒残粒和VLDL残粒。因此，LRP1在脂质代谢中发挥重要的作用。缺氧诱导因子1（Hypoxia inducible factor1，HIF-1）是细胞在缺氧条件下产生的核蛋白，它与靶基因结合，促进其转录，使机体产生一系列缺氧适应反应。在机体缺氧状态下可以诱导HIF-1的表达增加。HIF-1α是HIF-1的活性亚基。有研究表明，给予人平滑肌细胞低氧刺激后，其细胞内HIF-1α表达增加，从而进一步引起LRP1的表达增加[10]。
　　上述研究结果强烈提示，IH条件下肝细胞内HIF-1α及LRP1的水平也可能发生上述变化，且LRP1的升高可能是通过HIF-1α介导的。本研究通过建立大鼠及人肝癌细胞株HepG2细胞系IH模型，模拟OSAS患者的主要病理生理变化。(1)评价不同作用时间的IH对大鼠血脂的影响以及IH条件下大鼠肝脏LRP1与HIF-1α的变化。(2)评价IH条件下人肝癌细胞株HepG2细胞系LRP1以及HIF-1α的变化，并探讨该变化的可能机制。(3)评价IH条件下给予阿托伐他汀(Atorvastatin，A)干预后人肝癌细胞株HepG2细胞系LRP1以及HIF-1α的变化，探讨阿托伐他汀治疗OSAS脂质代谢紊乱的又一可能机制。
　　方法：
　　一、实验动物
　　成年雄性SD大鼠，体重300-350g，分为五组，1周组(1w)、2周组(2w)、3周组(3w)，4周组(4w)和对照组(C)，通过IH装置进行IH干预。干预后留取肝脏、血清标本。
　　二、人肝癌细胞株HepG2细胞系
　　体外培养HepG2细胞系，分成3部分进行:一部分细胞在对数生长期进行IH干预;一部分细胞先用YC-1进行预处理，然后再IH干预;第三部分细胞应用阿托伐他汀干预后进行IH干预。以上组别均设定空白对照。留取干预后的细胞进行分析。
　　三、Real-time RT-PCR
　　采用Trizol试剂提取大鼠肝细胞和HepG2细胞系中的总RNA，利用Real-timeRT-PCR试剂盒进行Real-time RT-PCR，应用7500Fast Real-Time PCR System进行扩增，并分析结果。
　　四、Western-blot
　　将总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，配置一抗稀释液LRP11∶500，HIF-1α1∶500，β-actin1∶5000。将条带应用TTBS略加清洗后分别放入一抗稀释液中，摇床上4℃杂交过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2000)摇床上室温杂交1h后，ECL法显影。
　　五、统计分析
　　用SPSS18.0统计包进行统计学分析，当P＜0.05时认为有统计学意义。
　　结果：
　　一、IH大鼠体重和进食量的变化
　　每组大鼠初始体重之间不存在显著差异，体重均随着时间的推移逐渐增加，且各组之间体重增加的幅度一致，各组之间在相同的时间点进行体重的比较，未发现存在显著差异（P＞0.05）。
　　二、IH大鼠血清TG、TC、LDL、HDL的变化
　　大鼠血清HDL在IH干预达到3周时出现了升高，在第4周时进一步升高。大鼠血清TC在IH干预达到3、4周时出现了升高，与对照组比较有统计学差异(P＜0.05)。大鼠血清LDL随着IH干预时间的延长，虽然有逐渐上升的趋势，但各组之间进行比较未出现统计学差异。大鼠血清TG在IH干预达到4周时出现了升高，与对照组和干预1周组比较有统计学差异（P＜0.05）。
　　三、IH大鼠肝脏LRP1、HIF-1α蛋白的变化
　　LRP1蛋白在IH2周后即出现统计学意义上的升高，并保持升高水平至4周。HIF-1α蛋白则从IH1周开始就出现升高，且维持在升高状态。
　　四、IH干预后HepG2细胞LRP1和HIF-1α的变化
　　与对照组比较，IH干预后的HepG2细胞LRP1 mRNA和蛋白，HIF-1αmRNA和蛋白的表达均明显升高（P＜0.05）。
　　五、YC-1联合IH干预后HepG2细胞LRP1和HIF-1α的变化
　　与IH组相比，IH+YC-1组HepG2细胞LRP1 mRNA及蛋白的表达明显下降(P＜0.05)。IH+YC-1组HepG2细胞HIF-1αmRNA的表达与IH组相比无明显统计学差异(P＞0.05)，而HIF-1α蛋白的表达与IH组相比明显下降(P＜0.05)。
　　六、给予阿托伐他汀(A)干预后，间歇低氧条件下HepG2细胞LRP1和ⅢF-1α的表达变化
　　与IH组相比，IH+A组LRP1 mRNA及蛋白的表达明显升高;与IH+A组相比，IH+A+YC-1组LRP1 mRNA及蛋白的表达明显降低。与IH组相比，IH+A组HIF-1α mRNA的表达无明显改变，但HIF-1α蛋白的表达明显升高。与IH+A组相比，IH+A+YC-1组的HIF-1α蛋白表达明显的下降。
　　结论：
　　1.IH导致大鼠部分血脂指标HDL、TG、TC升高，但不伴有体重和进食量的相应变化，且IH对血脂HDL、TG、TC的影响呈时间依赖性。
　　2.IH条件下大鼠肝脏LRP1和HIF-1α的表达水平明显升高，且HIF-1α的升高先于LRP1的升高。
　　3.IH条件下，人肝癌细胞株HepG2细胞LRP1和HIF-1α的表达明显增加。
　　4.给予HIF-1α特异性抑制剂YC-1处理后，人肝癌细胞株HepG2细胞HIF-1α的表达明显下降，同时LRP1的表达也明显减少。证实IH引起的LRP1表达上调是通过HIF-1α介导的。
　　5.给予阿托伐他汀干预后，IH作用下的HepG2细胞HIF-1αmRNA的表达水平无明显改变，但HIF-1α的蛋白水平明显增加。
　　6.给予阿托伐他汀干预后，IH作用下的HepG2细胞LRP1 mRNA及蛋白的表达水平明显升高。证明LRP1受到阿托伐他汀的调节。
　　7.应用阿托伐他汀的同时再给予YC-1干预，IH作用下的HepG2细胞LRP1mRNA及蛋白的表达水平明显下降，表明阿托伐他汀引起HIF-1α的表达上调，从而进一步引起其下游基因LRP1的表达上调。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 间歇低氧对大鼠脂质水平、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和缺氧诱导因子1α的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 间歇低氧对HepG2细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白1和缺氧诱导因子-1α表达的作用及其相互关系的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 阿托伐他汀对间歇低氧后HepG2细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白1和缺氧诱导因子-1α表达的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 OSAS与脂质代谢紊乱的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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