ABCB1和ABCG2基因多态性与肿瘤发病及预后的相关性研究

摘要

目的：
　　 随着世界人口日趋老龄化，预计全世界癌症死亡人数将继续上升，到2030年可能将超过1310万，且全球20％的新发癌症病人在中国，24％的癌症死亡病人在中国。在肿瘤患者绝对人数快速增长的同时，我国的癌谱也发生了较大变化:乳腺癌、大肠癌发病率迅速上升。预计到2015年，男性发病前3位的肿瘤为肺癌、肝癌和大肠癌，女性发病前3位的肿瘤为乳腺癌、肺癌和大肠癌。因此，肿瘤的早期预防并降低其发病率已成为亟待解决的现实课题。
　　 肿瘤在本质上是基因病。各种环境的和遗传的致癌因素以协同或序贯的方式引起DNA损害，从而激活原癌基因和（或）灭活肿瘤抑制基因，加上凋亡调节基因和（或）DNA修复基因的改变，继而引起表达水平的异常，使靶细胞发生转化。恶性肿瘤的基本治疗仍是手术切除，化疗，放疗等，其中化疗在恶性肿瘤的综合治疗中起着不可替代的作用，但治疗过程中多药耐药性(multi-drugresistance，MDR)的出现严重影响了治疗效果，也是造成肿瘤化疗失败和复发的主要原因，成为目前亟待解决的科学问题。
　　 研究表明30％～85％的个体间药物的转运体及代谢酶的活性差异主要是由遗传因素决定的。而编码ABC转运体家族成员的ABCB1、ABCG2基因等的序列差异可能会造成其mRNA、蛋白表达水平、转运活性及功能的差异，从而使其特异性转运底物（细胞毒性药物）在不同肿瘤患者的反应性造成明显差异。其中ATP-结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白是ATP依赖性药物外排泵，其表达或功能异常是肿瘤细胞产生MDR的重要机制之一。
　　 P-gp由位于人类染色体7q21.1的ABCB1基因所编码，由1280余个氨基酸残基组成的单链跨膜糖蛋白。其中多肽链占140kDa，由于糖基化程度的不同其分子质量略有变化，约为170kDa。自1989年Kioka等人首次发现ABCB1突变
　　 至今，已发现了50余个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms， SNPs)。其中，位于外显子21位的G2677T/A、26位的C3435T和12位的C1236T间有一定的连锁，连锁程度在不同种族间差异很大，且均具有重要的功能意义。目前许多研究提示ABCB1基因C1236T，G2677T/A和C3435T多态性与多种疾病的易感性密切相关。
　　 BCRP由位于人染色体4q22-23的ABCG2编码，包含2.4kb mRNA翻译的655个氨基酸残基、一个ATP结合域和一个疏水性跨膜结构域，可通过形成活性转运二聚体，以“药泵”的形式特异性减少胞内ATP依赖性药物（米托蒽醌、阿霉素、拓扑替康等）的蓄积，与多药耐药性产生密切相关。ABCG2遗传多态性也参与影响BCRP转运活性及底物代谢能力，与肿瘤发生发展及治疗疗效密切相关。其中，ABCG2 G34A和C421A在亚洲人群中最为常见，分布频率显著高于高加索人和美国非洲人。研究表明ABCG2 C421A多态对多种BCRP底物药的体内药物代谢动力学过程都有显著影响。此外，ABCG2 G34A和C421A还与肾细胞癌、前列腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL等疾病的发生与预后相关，但目前还尚未见ABCG2 G34A和C421A多态位点与乳腺癌感性、大肠癌化疗疗效的相关性研究。
　　 因此，尽早揭示这些SNPs的功能意义、阐明这些位点基因突变是否会影响细胞毒药物治疗作用仍是目前药物基因学研究领域中的重要课题之一。本实验拟从多耐耐药相关基因ABCB1，ABCG2多态性位点入手，通过病例-对照分析，通过PCR-RFLP方法及测序法分析位于ABCB1 C1236T，G2677T/A和C3435T、ABCG2基因G34A、C421A位点与肿瘤发病风险、患者的临床病例参数、临床化疗疗效及患者预后生存期的相关性，并探索各基因位点间的互作关系，验证后可作为候选基因分子标志物用于筛选高危人群，对肿瘤实施有效和目标明确的个体化治疗及预后判断等等均具有重要的意义。
　　 材料和方法：
　　 1、本研究采用了以医院为基础的病例-对照研究方法。病例组为2008年1月-2012年7月在中国医科大学附属第一医院及中国医科大学盛京医院进行住院治疗，均经组织病理学确诊，未经放射和抗癌药物治疗的乳腺癌、大肠癌新发病例;其中纳入乳腺癌患者1169例、大肠癌患者1028例;对照组分别纳入1240例及1230例，均为同期在同一医院体检中心进行健康体检且体检结果正常、无肿瘤病史及遗传病史且年龄、性别分别与病例组相匹配的健康志愿者人群。
　　 2、采用碘化钾法从抗凝血浆样本中提取全基因组DNA。通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(Poylmeares Chin Reaction Restriction Fragment LengthPoylmorphism，PCR-RFLP)及序列测定法检测ABCB1基因C3435T(rs1045642)，C1236T(rs1128503),G2677T/A(rs2032582)和ABCG2基因G34A(rs2231137),C421A(rs2231142)位点基因型及分布频率。ABCB和ABCG2基因的SNPs位点扩增引物如下:ABCB1 C3435T: Forward:5'-GATCTGTGAACTCTTGTTTTCA-3'，Reverse:5'-GAAGAG AGACTTACATTAGGC-3';ABCB1 C1236T: Forward:5'-TCTTTGTCACTTTAT CCAGC-3',Reverse:5'-TCTCACCATCCCCTCTGT-3';ABCB1 G2677T: Forward:5'-TGCAGGCTATAGGTTCCAGG-3', Reverse:5'-TTTAGTTTGACTCACCTTC CCG-3';ABCB1 G2677A: Forward:5'-TGCAGGCTATAGGTTCCAGG-3',Reverse:5'-GTTTGACTCACCTTCCCAG-3';ABCG2 G34A:Forward:5'-AAATGTTCAT AGCCAGTTTCTTGGA-3',Reverse:5'-ACAGTAATGTCGAAG TTTTTATCGC A-3; ABCG2 C421 A: Forward:5'-GTTGTGATGGGCACTCTGATGGT-3'，Reverse:5'-CAAGCCACTTTTCTCATTGTT-3'。将扩增出的PCR产物与相应的限制内切酶混合，并置于不同温度的水浴中消化4～16h，用3％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，进行基因型鉴定与分型。所有样本经PCR-RFLP法检测完毕后，将部分扩增好的PCR产物进行对比测序分析，进一步验证PCR-RFLP法基因分型结果的准确度及可靠性。
　　 3、统计学分析:本研究采用SPSS16.0统计学软件对上述数据库的数据进行统计学分析及处理，并以P＜0.05为差异有统计学意义。Pearsonx2检验比较两组间基本人口学资料的差异;Pearsonx2检验确定对照组人群是否符合Hardy-Weinberg平衡，并比较基因型的组间分布频率差异;应用非条件Logistic回归分析计算比值比(odds ratios，OR)和95％可信区间(confidence interval，CI),用以比较分析不同基因型与肿瘤易感性及临床化疗敏感性之间的相关性，并排除年龄、家族史等混杂因素的影响。本研究进一步采用Kaplan-Meier法的Log-rank检验、COX生存回归分析ABCB1及ABCG2基因多态性与患者术后采用不同化疗方案的预后相关性。
　　 结果：
　　 (1) ABCB1基因多态性与乳腺癌发病风险及临床疗效和预后的相关性
　　 1、ABCB1基因可能是乳腺癌易感候选基因;
　　 2、携带ABCB1 C3435T T等位基因、G2677T/A T等位基因、单倍体3435T-1236T-2677T/A使乳腺癌发病风险明显增高;
　　 3、ABCB1 C3435T、G2677T/A与ER/PR表达的不同状态存在相关性;
　　 4、携带ABCB1C3435T CT/TT、CT+TT基因型3434TT-1236TT-2677TT单倍体的患者（n=148）对蒽环类为基础的新辅助化疗疗效更佳;
　　 5、携带ABCB1 C3435T CT+TT基因型可使术后蒽环类化疗的TNBC患者(n=135) PFS或者OS明显延长;
　　 6、携带ABCB1 C3435T CT或TT基因型可使术后紫杉醇化疗的乳腺癌患者(n=79)的PFS或者OS明显延长;
　　 7、携带ABCB1 G2677T GT基因型可使术后环类+紫杉醇类联合化疗的乳腺癌患者(n=101)的OS明显延长。
　　 (2) ABCG2基因多态性与乳腺癌发病风险及临床疗效和预后的相关性
　　 1、ABCG2基因可能是乳腺癌易感候选基因;
　　 2、携带ABCG2 G34A A等位基因、C421A A等位基因、单倍体34A-421A使乳腺癌发病风险明显增高;
　　 3、ABCG2C421A位点与ER/PR表达的不同状态存在相关性;
　　 4、携带ABCG2 C421A AA基因型的患者（n=148）对蒽环类为基础的新辅助化疗疗效更佳;
　　 5、携带G34A A等位基因使采用蒽环类化疗的患者(n=831)的生存期延长;
　　 6、携带C421A CA或CA+AA基因型可使采用蒽环类化疗的乳腺癌患者（n=831）的PFS或者OS明显延长;
　　 7、TNBC患者(n=135)携带C421A CA+AA基因型且应用蒽环类化疗的疗效较好，患者生存期延长;
　　 8、经多因素COX分析发现携带C421A CA或CA+AA基因型可使采用紫杉醇化疗的乳腺癌患者（n=79）的PFS明显延长;
　　 9、经多因素COX分析发现携带C421A AA基因型可使蒽环类+紫杉醇类联合化疗(n=101)患者的OS明显延长。
　　 (3) ABCB1基因多态性与大肠癌发病风险及临床疗效和预后的相关性
　　 1、ABCB1基因可能是大肠癌易感候选基因;
　　 2、携带C3435T CC或CT基因型及CC+CT基因型使大肠癌的发病风险明显提高;
　　 3、携带ABCB1 G2677T/A GT/GA基因型及GT+GA+TT+AA基因型使大肠癌发病风险明显提高;
　　 4、携带ABCB1C1236T不同基因型与大肠癌发病风险无相关性;
　　 5、携带ABCB1单倍体3435T-1236T-2677T使大肠癌发病风险明显增高;
　　 6、ABCB1 C3435T位点不同基因型与患者的临床病理参数（肿瘤的分化程度、病理分期）在分布频率上存在统计学差异;G2677T/A位点不同基因型与肿瘤大小在分布频率上存在统计学差异;
　　 7、单因素Log-rank检验结果发现携带C3435T CC+CT基因型使铂类化疗患者（n=831）的PFS和OS均延长，但经多因素COX回归分析，并未发现其为独立风险预后因子;
　　 8、应用Log-rank检验和多因素COX回归分析的结果均发现携带ABCB1C1236T CT+TT基因型能显著延长铂类化疗患者(n=762)的OS，提示ABCB1 C1236T位点与大肠癌的预后密切相关;
　　 9、经Log-rank检验和多因素COX回归分析均证实携带ABCB1单倍体3435TT-1236TT-2677TT能显著延长铂类化疗患者（n=762）的PFS，提示其可作为大肠癌铂类化疗患者的独立预后因子之一。
　　 (4) ABCG2基因多态性与大肠癌发病风险及临床疗效和预后的相关性
　　 1、ABCG2基因可能是大肠癌易感候选基因;
　　 2、携带ABCG2 G34A位点A等位基因、C421A位点A等位基因、单倍体34A-421C和34G-421A均使大肠癌发病风险明显增高;
　　 3、携带ABCG2 G34A GG基因型分布频率在较大肿瘤(＞2cm)明显增加;
　　 4、应用Log-rank检验和多因素COX回归分析的结果均未发现携带G34A位点不同基因型与大肠癌患者采用不同化疗方案的预后存在相关性;
　　 5、采用Log-rank检验分析发现携带ABCG2 C421A位点CA+AA基因型与铂类化疗患者的PFS延长密切相关;但经多因素Cox回归分析并未发现其为独立预后因子。
　　 结论：
　　 1、ABCB1 C3435T、G2677T/A、单倍体3435T-1236T-2677T和ABCG2G34A、C421A多态性及单倍型34A-421A使乳腺癌发病风险增加;
　　 2、携带ABCB1 C3435T突变型或单倍体3434TT-1236TT-2677TT及ABCG2C421A突变型使患者对术前蒽环类新辅助化疗应答反应提高;
　　 3、携带ABCB1 C3435T突变型、ABCG2 C421A突变型可明显延长术后蒽环类化疗的TNBC患者或者紫杉醇化疗乳腺癌患者的生存期;
　　 4、携带ABCB1 G2677T杂合型、ABCG2C421A突变型能显著延长蒽环类+紫杉醇类联合化疗患者的生存期;
　　 5、ABCB1 C3435T、G2677T/A、单倍体3435T-1236T-2677T和ABCG2G34A、C421A多态性及单倍型34A-421C、34A-421A使大肠癌发病风险明显增加;
　　 6、ABCB1 C1236T突变型能显著延长铂类化疗大肠癌患者的OS，而单倍体3435TT-1236TT-2677TT能显著延长铂类化疗大肠癌患者的PFS，但与5-氟尿嘧啶为基础化疗的预后不相关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：ABCB1和ABCG2基因多态性与乳腺癌易感性、临床疗效及预后的相关性研究

论文一 ABCB1 C3435T、C1236T、G2677T／A与乳腺癌发病风险、临床疗效及预后的相关性分析

前言

材料与方法

实验结果

小结

论文二 ABCG2 G34A、C421A与乳腺癌发病及临床疗效和预后的相关性分析

前言

材料与方法

实验结果

小结

第二部分 ABCB1，ABCG2基因多态性与中国人群大肠癌易感性及临床预后相关性研究

论文三 ABCB1 C3435T、C1236T、G2677T／A与大肠癌发病风险及临床疗效和预后的相关性分析

前言

材料与方法

实验结果

小结

论文四 ABCG2 G34A、C421A与大肠癌发病风险及临床疗效和预后的相关性分析

前言

材料与方法

实验结果

小结

讨论

结论

四、本研究创新性的自我评价

参考文献

附录

综述

在学期间科研成绩

致谢

个人简介