兔新型腹主动脉瘤模型的建立及强力霉素缓释涂层覆膜支架防治兔腹主动脉瘤腔内修复术后内漏的研究

摘要

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是一种发病隐匿、对健康危害极大、自然预后极差的血管常见疾病。大多数AAA患者无症状，动脉瘤逐渐扩张并最终破裂。1991年Parodi等[1]首次提出的主动脉瘤腔内修复治疗(endovascularaortic aneurysm repair, EVAR)，较传统开腹修复术具有创伤小、手术并发症少、住院时间短和适应证广泛等优点[2]。EVAR技术存在靶血管局部的并发症，如内漏、支架移位，支架感染等，其中内漏可导致瘤体增大甚至破裂。尽管主动脉覆膜支架能够达到对病变主动脉局部的机械性修复目的[3]，但由于靶血管局部不能及时自我再生和修复，与主动脉覆膜支架之间几乎没有组织学上的愈合，更不能诱导动脉瘤的机化，从而造成覆膜支架与主动脉壁之间附着不牢固和内漏持续存在等问题。因此，如何促进主动脉壁自我增生和局部修复，并与所置入的主动脉覆膜支架牢固愈合，从而有效地消除内漏和防止支架移位的问题，已成为一个新的、令人关注的研究热点。
　　 AAA特征性表现包括中膜外膜慢性炎性细胞浸润、细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)降解和平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)凋亡等，但其发病机制目前尚不十分明确。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在AAA的发生、发展中起重要作用[4]。越来越多的证据表明四环素类抗生素在体外及动物模型中均能广谱抑制MMPs。强力霉素在动物实验中已取得一致的疗效，而且四环素衍生物作为MMPs抑制剂已治疗多种临床疾病，如痤疮、牙周炎、关节炎和其它慢性疾病等。目前为止，强力霉素是在防治AAA形成、发展的研究方面应用最广泛的代表性药物，可抑制MMPs和AAA发展，可能最具有临床应用前景。
　　 强力霉素全身给药可有效降低患者动脉壁及血清中MMP9水平[5]，抑制啮齿动物模型中AAA发展[6，7]。然而，口服给药可引起一系列副作用，如非特异性胃肠道反应、牙齿变色、菌群失调[5]、光敏反应，还可导致啮齿动物体重下降，一定程度上限制了该药物的长期应用。局部缓释给药可有效减少全身给药引起的副作用。此外，传统弹性蛋白酶诱导的兔AAA模型存在自我修复现象，与人动脉瘤疾病不符，且该建模方法操作复杂。本研究选择新西兰大白兔作为实验动物诱导新型AAA模型，以生物可降解材料聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]涂层的主动脉覆膜支架作为载药平台，以实现强力霉素在主动脉局部的缓慢释放，研究和探讨支架表面涂层缓释的药物对主动脉局部组织愈合方面的影响。
　　 材料与方法：
　　 一、兔AAA模型的建立
　　 1、传统弹性蛋白酶诱导兔AAA模型及随访观察
　　 24只雄性新西兰大白兔(2.40±0.38 kg)随机分成4组，B组、C组和D组分别采用浓度为0.1、5和10 U/μl的弹性蛋白酶溶液浸润，A组采用不含弹性蛋白酶的生理盐水浸润作为对照。5天时取材进行病理分析。采用相同的方法，即10μl弹性蛋白酶溶液（浓度为10 U/μl）浸润30分钟诱导建立12只AAA模型用于随访（E组）。所有动物术后均采用1％胆固醇饲料喂养。
　　 2、采用湍流联合主动脉周弹性蛋白酶浸润诱导新型兔AAA模型
　　 51只雄性新西兰大白兔(2.28±0.33 kg)随机分成狭窄组(n=12)，蛋白酶组(n=12)、动脉瘤组(n=15)和对照组(n=12)。狭窄组仅部分结扎肾下腹主动脉，将直径约为1.3 mm无菌枪头尖端与肾下腹主动脉一起结扎，撤走枪头使其残留管腔直径约1.3 mm左右。蛋白酶组采用60μl弹性蛋白酶溶液(1 U/μl)主动脉周浸润10分钟，动脉瘤组结合狭窄组和蛋白酶组的处理。以生理盐水浸泡肾下腹主动脉10分钟，部分结扎游离段近端后即刻剪开结扎线作为假手术对照组。分别于术后1周、2周、4周、8周和16周随访直径变化并进行病理分析。
　　 二、强力霉素PLGA缓释涂层覆膜的制备及其在兔AAA周的应用
　　 称取10 mg强力霉素，90 mg PLGA充分溶于1 ml二氯甲烷有机溶剂中。将医用人工血管切成约3×5 mm小片，平铺于聚四氟乙稀板上，微量移液器各取100μl上述溶液滴于每片人工血管上，于-20℃中静放24小时使二氯甲烷缓慢释放，干燥后环氧乙烷消毒备用。16只雄性新西兰大白兔随机分成4组，采用上述主动脉周弹性蛋白酶浸润联合湍流方法诱导12只AAA，分别于浸润段周围包裹上述强力霉素缓释覆膜(Dox+AAA，n=4)和不含强力霉素的PLGA涂层覆膜(Nor+AAA，n=4)，动脉瘤组主动脉周未包裹覆膜(AAA，n=4)。以生理盐水浸泡肾下腹主动脉，部分结扎后即刻剪开结扎线，且不包裹覆膜治疗作为假手术对照组(SHAM，n=4)。术后1周和4周采用IVDSA随访内径变化，4周后取材进行病理分析。
　　 三、强力霉素PLGA涂层覆膜支架的制备及腔内修复治疗
　　 将医用导丝内芯折成6个支杆的Z型支架，支杆长16mm，支架直径为4mm。采用医用聚氨酯作为覆膜，并将覆膜支架放入上述强力霉素PLGA溶液中浸泡10分钟，于-20℃中静放24小时使二氯甲烷缓慢释放。以不含强力霉素的PLGA溶液浸泡10分钟的覆膜支架作为对照。干燥后环氧乙烷消毒备用。12只雄性新西兰兔(2.19±0.15 kg)采用10μl弹性蛋白酶溶液（10 U/μl）主动脉周浸润30分钟诱导动脉瘤形成，随机分成两组，于术后5天对AAA进行腔内修复治疗，分别置入含药覆膜支架和单纯覆膜支架各6枚。EVAR术后4周取材进行病理分析。
　　 四、经静脉数字减影血管造影
　　 内径测量采用经静脉数字减影血管造影(intravenous digital subtractionangiography, IVDSA)方法进行，IVDSA是一种可用于兔AAA测量的替代方法。以24-G静脉输液针成功穿刺兔耳缘静脉后留置，将6ml非离子型造影剂于3秒内推注入静脉中。造影过程中将长度为1 cm金属标记放置于兔下方，作为直径测量的参考标准。弹性蛋白酶浸润的动脉腔直径较浸润前增大50％以上定义为AAA形成。
　　 五、组织学分析
　　 静脉推注过量戊巴比妥钠注射液处死动物并取材，固定于4％多聚甲醛溶液中。标本脱水后，石蜡包埋，切成5μm厚连续横断面切片，分别进行苏木素-伊红染色(haematoxylin and eosin，HE)、弹力纤维酸性品红染色(elastic van-Gieson，EVG)和0.1％饱和苦味酸-天狼星红(picrosirius red，PSR)染色。采用图像软件测量内膜、中膜厚度，半定量分析弹力纤维和胶原纤维含量。
　　 六、免疫组织化学分析
　　 采用超敏SP法检测MMP2、MMP9、巨噬细胞（RAM11）和内皮细胞(CD31)。石蜡切片脱蜡、水化后，1％过氧化氢室温孵育10～20分钟阻断内源性过氧化物酶。采用10％山羊血清封闭，加一抗MMP2（1∶150稀释）、MMP9（1∶300稀释）、RAM11（1∶100稀释）和CD31（即用型）4℃过夜。PBS洗3遍后，与生物素化山羊抗小鼠IgG室温孵育20分钟。DAB显色后，于200×视野下随机观察、评分。阳性率大于50％为强阳性表达，计3分，阳性率为10％～50％为中度表达，计2分，表达阳性率不足10％计1分。内皮细胞覆膜率由CD31阳性内皮层长度除以总的内皮长度得出，并以百分比形式表示。SMC免疫荧光染色中，血清封闭后加一抗α-actin（1∶150稀释）4℃孵育过夜。PBS洗3遍后，与异硫氰酸荧光素(fluorescein Isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗小鼠IgG室温下避光孵育1小时。采用图像分析软件计算SMC含量。
　　 七、统计学分析
　　 各组数据以均数±标准差的形式表示，用GraphPad Prism5.0统计软件对数据进行单因素方差分析和重复测量单因素方差分析。P＜0.05认为有统计学差异。
　　 结果：
　　 一、传统弹性蛋白酶诱导兔AAA模型随访观察
　　 D组所有动物均形成AAA，C组仅1例动脉瘤形成，A组和B组均未见动脉瘤形成。E组5天时直径增大至术前的1.66±0.09倍，该直径在100内保持稳定，100天以后直径逐渐缩小，150天时直径仅为术前直径的1.36±0.28倍。D组动脉瘤壁明显变薄，结构紊乱，SMC数量减少，弹力纤维破坏，几乎消失，MMP2和MMP9表达增高，伴有巨噬细胞浸润。E组随访中发现SMC不断向内膜迁移、增殖，导致内膜显著增生，弹力纤维及胶原纤维含量增多，除MMP2保持中度表达外， MMP9和RAM11均为弱表达，150天时仅增厚的内膜处可见RAM11阳性细胞。
　　 二、采用湍流联合主动脉周弹性蛋白酶浸润诱导新型兔AAA模型
　　 动脉瘤组术后1周成瘤率为80％，2周后所有观察动物均形成动脉瘤，随访至16周仍可见动脉瘤进一步增大。狭窄组直径逐渐增大，假手术组未见AAA形成。动脉瘤血流呈双向频谱分布，可见狭窄后喷射状血流，瘤内五彩色湍流形成。该新型动脉瘤术后弹力纤维减少，内膜轻度增生，内皮覆盖率减小，术后1周Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维明显破坏，此后逐渐增多。术后1周MMP2和MMP9表达显著增高，伴有巨噬细胞浸润，2周后MMP2保持中度表达，而MMP9和炎症细胞浸润逐渐恢复正常。
　　 三、强力霉素PLGA缓释涂层覆膜动脉瘤周的应用
　　 含药覆膜组术后1周仅一例AAA形成，直径增大50.6％，4周时直径未明显增大(54.6％)。而单纯覆膜组和动脉瘤组术后1周均形成动脉瘤，直径显著高于含药覆膜组(P＜0.01)，4周时该两组直径进一步增大，单纯组和动脉瘤直径分别增大至4.75±0.41 mm和5.83±1.05 mm，均高于含药覆膜组。假手术组未见动脉瘤形成。造瘤各组均可见内膜增生，术后4周弹力纤维含量显著低于假手术组(P＜0.0001)，含药覆膜组可见弹力纤维层部分保留，其含量虽略高于单纯覆膜组和动脉瘤组，但差异无统计学意义。各组胶原纤维含量，包括Ⅰ型胶原纤维、Ⅲ型胶原纤维含量均无明显差异。单纯覆膜组和动脉瘤组术后MMP2和MMP9显著高于假手术组(P＜0.0001)，强力霉素覆膜组MMP2和MMP9表达显著下降，恢复至假手术组水平。
　　 四、强力霉素PLGA涂层覆膜支架的制备及腔内修复治疗
　　 术后5天12只兔均形成AAA，覆膜支架置入后成功隔绝动脉瘤腔，术后即刻支架内血流通畅，IVDSA随访均未见直径进一步增大。腔内修复治疗的动脉瘤壁受压变薄，金属支架支杆处表现更为明显。单纯覆膜支架组覆膜与血管壁之间缺乏生物学愈合，其中7天死亡者可见大量炎症细胞聚集于覆膜上，血管壁内也存在大量炎症细胞浸润，而未见血栓机化。含药覆膜支架组炎症反应轻，覆膜上几乎未见炎症细胞浸润，覆膜与血管壁之间可见内膜增生、修复，两者结合紧密。含药覆膜支架组MMP2和MMP9为弱表达，明显低于单纯覆膜支架组(P＜0.05)。术后4周时以巨噬细胞为主的极少量炎症细胞浸润主要集中于血管壁外膜，为弱表达，各组间无明显差异。
　　 结论：
　　 1、采用10 U/μl弹性蛋白酶溶液主动脉周浸润30分钟可诱导兔AAA形成，该方法简单、易行、有效，诱导时间短，主动脉扩大迅速。该动脉瘤100天内直径保持稳定，可用于研究AAA形成与发展机制，其后自我修复明显，这与人动脉瘤疾病不符。
　　 2、兔主动脉周弹性蛋白酶浸润联合狭窄后湍流可有效诱导AAA形成。该新型动脉瘤模型表现为炎症细胞浸润，弹力纤维、SMC含量减少，内皮覆盖率减小，MMP2和MMP9表达上调，且直径不断增大，可更好地模拟人AAA疾病。
　　 3、强力霉素缓释涂层覆膜可提高主动脉壁ECM合成与降解的平衡，抑制动脉瘤发展而不导致不良反应。
　　 4、强力霉素缓释涂层覆膜支架可用于治疗AAA，提高覆膜支架与血管壁的生物愈合。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 传统弹性蛋白酶诱导兔腹主动脉瘤模型随访观察及其应用价值评价

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 采用主动脉周弹性蛋白酶浸润联合狭窄所致血流动力学改变诱导新型兔腹主动脉瘤模型

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 强力霉素缓释涂层覆膜主动脉瘤周应用防治兔腹主动脉瘤及其覆膜涂层支架在动脉瘤内置入的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

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