豚鼠实验性近视眼后极部巩膜蛋白聚糖水平变化及阿托品对其影响的研究

摘要

目的：
　　近视的发病率逐渐升高，目前全世界30％的人群患有近视。实验性近视模型的建立为近视眼的研究提供了基础。一般通过形觉剥夺和透镜诱导来诱导实验性近视，他们是两类本质上完全不同的近视，但两种动物模型都造成近视度数加深，眼球轴性延长和巩膜的异常生长。在近视眼的发展中巩膜在调节眼轴长度中起重要作用，因而巩膜的变化在轴性近视的发生中显得尤为重要。蛋白聚糖是巩膜细胞外基质的主要成分，同时蛋白聚糖对巩膜的生长及代谢有重要的调节作用。在哺乳动物中巩膜蛋白聚糖的主要成分为双链蛋白聚糖(biglycan)、蛋白聚糖聚合物（aggrecan）、饰胶原蛋白聚糖(decorin)和纤调蛋白聚糖(fibromodulin)。本实验通过观察豚鼠形觉剥夺性近视(FDM)与透镜诱导性近视(LIM)后极部巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin水平的变化，研究两种实验性近视是否存在相同的巩膜重塑机制。并采用结膜下注射阿托品观察其对FDM、LIM形成的影响，同时观察阿托品对形觉剥夺性和透镜诱导性近视后极部巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin含量的影响，探讨阿托品抑制实验性近视的可能机制。
　　方法:
　　实验动物:4周龄三色短毛豚鼠，体重150-175克，由中国医科大学实验动物中心提供。健康无眼疾。动物饲养温度20-25℃，光照黑暗周期比14h∶10h，喂食豚鼠专用饲料，添加维生素C。白天2小时观察一次，镜片污染或脱落、眼罩脱落及时清洁和固定。14天后在暗室中去除镜片和眼罩。
　　实验一:28只正常4周龄三色短毛豚鼠随机分3组，组1为正常对照组6只，组2为FDM组11只，组3为LIM组11只。给予连续形觉剥夺或镜片诱导14天，实验前和实验后分别测量豚鼠眼的屈光度和眼轴长度，14天后处死动物进行后极部巩膜的光镜、电镜观察。
　　实验二:取实验一动物的后极部巩膜4×4mm投入10％甲醛中固定，常规进行免疫组织化学染色，在光学显微镜下观察aggrecan、biglycan、fibromodulin的表达。使用图像采集系统采集各指标免疫组化图像，显微图像分析系统检测各指标OD值。另取离体眼球后极部巩膜片(5×5mm)，利用反转录-聚合酶链式反应检测豚鼠后极部巩膜中aggrecan、biglycan和fibromodulin的mRNA的表达。凝胶图像分析系统观察电泳结果并摄像，经分析软件进行分析，计算目的基因的mRNA的相对含量。
　　实验三:44只正常4周龄三色短毛豚鼠随机分7组，组1为正常对照组6只，组2为FDM组6只，组3为LIM组6只，组4为FDM+阿托品组7只，组5FDM+盐水组6只，组6为LIM+阿托品组7只，组7为LIM+盐水组6只。组2组3给予连续形觉剥夺或镜片诱导14天。组4、6实验眼每天给予结膜下注射1％阿托品100μl至14天。组5、7实验眼每天给予结膜下注射无菌生理盐水100μl至14天。实验前和实验后分别测量豚鼠眼的屈光度和眼轴长度，反转录-聚合酶链式反应检测各组豚鼠后极部巩膜中aggrecan、biglycan、fibromodulin和TGF-β1 mRNA的表达，免疫组织化学方法检测后极部巩膜中aggrecan、biglycan和fibromodulin核心蛋白的表达。
　　统计学分析:各组数据做方差齐性检验。空白对照组与实验组的各组数据采用单因素方差分析的方法，并做两两比较。实验眼与对侧眼之间采用配对计量资料的均数t检验。采用SPSS16.0软件分析。
　　结果:
　　实验一
　　实验后FDM组和LIM组，实验眼屈光度分别为-3.05±0.71D和-2.12±1.29D，与正常组及对照眼比较差别有统计学意义(P＜0.01)，FDM、LIM实验眼间屈光状态无统计学意义(P＞0.05)。
　　FDM组实验眼眼轴长度为7.93±0.03mm，LIM组实验眼眼轴长度7.89±0.06mm，分别与正常组和对照眼的眼轴长度比较有统计学意义(P＜0.01)，FDM和LIM间眼轴长度和屈光度比较没有统计学意义(P＞0.05)。
　　形态学变化:光镜下观察FDM组和LIM组实验眼巩膜变薄，胶原纤维排列紊乱，间隙变大。电镜观察可见后极部巩膜胶原纤维变细，纤维母细胞变性。
　　实验二
　　后极部巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin核心蛋白的免疫组织化学检测结果:aggrecan、biglycan、fibromodulin核心蛋白阳性染色为巩膜细胞外基质中棕色丝状不定形物质，围绕在胶原纤维周围，与胶原纤维走形相同。正常豚鼠后极部巩膜中三种蛋白聚糖核心蛋白均有阳性表达。形觉剥夺、透镜诱导性近视眼巩膜中三者的表达下降，与对照眼比较存在显著性差异(P＜0.01)，形觉剥夺、透镜诱导性近视眼间巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin核心蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。
　　RT-PCR结果:FDM组、LIM组实验眼后极部巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin mRNA表达趋势与蛋白水平一致，FDM组、LIM组实验眼对照眼比较aggrecan、biglycan、fibromodulin mRNA表达明显下调，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　实验三
　　经过14天实验，FDM+阿托品组实验眼的屈光度、眼轴长度与正常眼比较无显著性差异(P＞0.05)，未形成近视，与FDM组和FDM+盐水组实验眼比较有显著性差异(P＜0.01)。LIM+阿托品组实验眼的屈光度、眼轴与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，亦未形成近视，与LIM组和LIM+盐水组实验眼比较有显著性差异(P＜0.01)。
　　RT-PCR结果:FDM+阿托品组实验眼后极部巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin、TGF-β1的mRNA表达水平与FDM组、FDM+盐水组实验眼比较出现明显上调(P＜0.01);LIM+阿托品组实验眼aggrecan、biglycan、fibromodulin、TGF-β1 mRNA表达与LIM组和LIM+盐水组比较明显上调，有统计学意义(P＜0.01)。
　　免疫组织化学结果:后极部巩膜组织aggrecan、biglycan、fibromodulin核心蛋白的表达与mRNA表达趋势一致，FDM+阿托品组实验眼与FDM+盐水组比较有统计学意义(P＜0.01)，LIM+阿托品组与LIM+盐水组比较具有统计学意义(P＜0.01)。
　　结论:
　　(1)豚鼠对形觉剥夺和透镜诱导均敏感，可以诱导形成轴性近视。本研究采用自制的尼龙子母扣进行遮盖和镜片诱导的方法具有摘戴方便无创伤性的优点适合制作干预模型。
　　(2)正常豚鼠后极部巩膜有aggrecan、biglycan、fibromodulin核心蛋白的表达。经形觉剥夺及透镜诱导后豚鼠后极部巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin的表达与对照眼相比较显著降低，后极部巩膜中aggrecan、biglycan、fibromodulin参与了形觉剥夺性近视和透镜诱导性近视的形成。
　　(3)形觉剥夺和透镜诱导性近视在14天的诱导期内形成的近视在屈光度和眼轴长度上不存在差异。
　　(4)形觉剥夺性近视和透镜诱导性近视豚鼠后极部巩膜中aggrecan、biglycan、fibromodulin含量相比较无统计学差异，说明两种类型的近视形成中，巩膜重塑存在相似的机制。
　　(5)结膜下注射阿托品能够抑制豚鼠形觉剥夺和透镜诱导性近视的形成。阿托品抑制豚鼠形觉剥夺和透镜诱导性近视后，豚鼠后极部巩膜aggrecan、biglycan、fibromodulin、TGF-β1表达显著上调。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 豚鼠形觉剥夺性近视和透镜诱导性近视的模型建立

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 豚鼠实验性近视后极部巩膜蛋白聚糖水平的改变

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 阿托品对实验性近视的作用及其对后极部巩膜蛋白聚糖影响的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 实验性近视的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介