铅暴露对不同发育阶段仔鼠海马谷氨酸代谢的影响及其机制研究

摘要

铅是环境中广泛存在的重金属污染物，具有很强的神经毒性。儿童是铅暴露的易感人群，研究显示，铅可对儿童的学习记忆功能造成永久性的损伤。迄今，在铅对学习、记忆损害方面的研究虽然取得了一些进展，但其具体机制仍不清楚，还有待进一步的研究。
　　谷氨酸(glutamate，Glu)是哺乳动物中枢神经系统中含量最丰富的兴奋性氨基酸类神经递质，也是与LTP的诱导与维持等脑高级神经活动密切相关的重要神经递质。Glu也具有兴奋性神经毒性，细胞外过多的Glu可引起神经元的损伤，甚至死亡。谷氨酸-谷氨酰胺循环是中枢神经系统中神经胶质细胞和神经元代谢偶联的重要途径之一，其在维持中枢神经系统内Glu的正常代谢、清除突触间隙内Glu、防止Glu对神经元的兴奋性毒性中发挥关键性作用。星形胶质细胞（Astrocyte，AS）是脑组织中数量最多的细胞群体，其功能不仅仅是支持、保护和营养神经元，它还参与突触间隙神经递质的清除与代谢、促进突触的形成与参与突触可塑性的调控。AS上表达高亲和力的谷氨酸转运体，包括GLAST(Glutamate/Aspartatetransporter)和GLT-1（Glutamate transporter-1）。此外，AS内还表达其独有的谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase，GS）。故AS不仅能快速清除突触间隙的Glu，而且能对摄入的Glu进行代谢转化。故如果AS内的铅引起Glu代谢相关环节的损伤，将严重干扰谷氨酸能神经突触的信息传递，损伤脑的学习记忆等高级神经活动，成为铅神经毒性的初始损伤环节之一。
　　基于以上理论，本研究以昆明种小鼠为研究对象，通过探讨铅对不同发育阶段仔鼠海马组织中Glu代谢相关环节的影响，为揭示铅神经毒作用机制提供实验参考数据。
　　方法：
　　1、实验动物分组与染毒
　　选择健康、清洁级昆明种小鼠的孕鼠80只，随机分成对照组及0.5、1.0和2.0 g/L乙酸铅暴露组。从受孕第一天开始以自由饮水方式染铅，对照组孕鼠饮蒸馏水。分娩后，各实验组的母鼠和仔鼠继续饮含铅水至实验结束。
　　2、指标测定
　　乙醚麻醉后，分别断头处死出生后(postnatal day, PND)10、20和40天的仔鼠，快速取脑组织，低温下剥离双侧海马，称重。
　　2.1仔鼠脑铅含量测定
　　采用石墨炉原子吸收光谱法检测不同发育阶段仔鼠脑组织铅含量。2.2仔鼠空间学习与记忆能力的测定
　　用Morris水迷宫法检测PND40仔鼠的空间学习与记忆能力，测试包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。
　　2.3仔鼠海马中GS活性测定
　　采用南京建成生物工程研究所的GS活性试剂盒进行检测，于酶标仪上测定550 nm处OD值。
　　2.4仔鼠海马中GS、GLAST和GLT-1 mRNA和蛋白表达测定
　　采用Real time RT-PCR法和Western-blot法检测不同发育阶段仔鼠海马中GS、GLAST和GLT-1 mRNA和蛋白的表达。
　　3、统计分析
　　实验数据采用SPSS13.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用SNK。以P＜0.05作为差异有统计学意义的判定标准。
　　结果：
　　1、铅暴露对不同发育阶段仔鼠体重增长的影响
　　各染铅组的PND10和20仔鼠体重与对照组比较未见显著差异，仅2.0 g/L染铅组的PND40仔鼠体重显著低于对照组。
　　2、铅暴露对不同发育阶段仔鼠脑脏器系数的影响
　　各染铅组的PND10和20仔鼠脑脏器系数与对照组比较均未见显著差异，仅2.0 g/L染铅组的PND40仔鼠脑脏器系数显著高于对照组及0.5 g/L和1.0 g/L染铅组。
　　3、铅暴露对不同发育阶段仔鼠脑铅含量的影响
　　2.0 g/L染铅组的PND10、20和40仔鼠脑铅含量均显著高于对照组及其它染铅组，1.0 g/L染铅组的PND20和40仔鼠及0.5 g/L染铅组的PND40仔鼠脑铅含量也显著高于对照组。
　　4、铅暴露对不同发育阶段仔鼠空间学习与记忆能力的影响
　　在定位航行实验中，各染铅组的PND40仔鼠的寻找平台潜伏期从训练第2天起，随染铅剂量的增加而延长，且各染铅组与对照组的差异均有统计学意义;从训练第3天起，2.0 g/L染铅组与其它染铅组的差异有统计学意义;从训练第4天起，各染铅组之间的差异均有统计学意义。
　　在空间探索实验中，各染铅组的PND40仔鼠在第Ⅱ象限停留时间随染铅剂量的增加而减少，其中1.0和2.0 g/L染铅组与对照组和0.5 g/L染铅组的差异均有统计学意义，此外，2.0 g/L染铅组与1.0 g/L染铅组的差异也有统计学意义。
　　5、铅暴露对不同发育阶段仔鼠海马中GS活性的影响
　　2.0 g/L染铅组的PND10、20和40仔鼠、1.0 g/L染铅组的PND20和40仔鼠及0.5 g/L染铅组的PND40仔鼠的海马中GS酶活性均显著低于对照组;此外，2.0 g/L染铅组的PND20和40仔鼠的海马中GS酶活性也显著低于0.5 g/L铅暴露组。
　　6、铅暴露对不同发育阶段仔鼠海马中GS表达的影响
　　2.0 g/L染铅组的PND40仔鼠海马中GS mRNA含量显著低于对照组;各染铅组的PND10和20仔鼠与对照组的差异均无统计学意义。
　　2.0 g/L染铅组的各发育阶段仔鼠海马中GS蛋白水平均显著低于对照组及其它染铅组;1.0 g/L染铅组的不同发育阶段仔鼠海马中GS蛋白水平均显著低于对照组，其中PND20和40仔鼠的海马中GS蛋白水平也显著低于0.5 g/L染铅组;0.5 g/L染铅组的不同发育阶段仔鼠与对照组的差异均无统计学意义。
　　7、铅暴露对不同发育阶段仔鼠海马中GLAST表达的影响
　　2.0 g/L染铅组的PND40仔鼠海马中GLAST mRNA含量显著低于对照组和0.5 g/L染铅组;1.0 g/L染铅组的PND40仔鼠海马中GLAST mRNA含量显著低于对照组;各染铅组的PND10和20仔鼠海马中GLAST mRNA含量与对照组的差异均无统计学意义。
　　2.0 g/L染铅组的PND20和40仔鼠海马中GLAST蛋白水平均显著低于对照组及其它染铅组，1.0 g/L染铅组的PND20和40仔鼠海马中GLAST蛋白水平也显著低于对照组。各染铅组的PND10仔鼠海马中GLAST蛋白水平与对照组的差异均无统计学意义。
　　8、铅暴露对不同发育阶段仔鼠海马中GLT-1表达的影响
　　2.0 g/L染铅组的PND40仔鼠海马中GLT-1 mRNA含量显著低于对照组及其它染铅组;各染铅组的PND10和20仔鼠与对照组的差异均无统计学意义。
　　2.0 g/L染铅组的各发育阶段仔鼠海马中GLT-1蛋白水平显著低于对照组及其它染铅组;1.0 g/L染铅组的PND20和40仔鼠海马中GLT-1蛋白水平均显著低于对照组及0.5 g/L染铅组。
　　结论：
　　1、发育早期饮水铅暴露可引起不同发育阶段仔鼠脑铅含量随染铅浓度与时间的增加而不断累积。
　　2、饮水铅暴露可明显损伤仔鼠的空间学习能力，较高水平铅暴露对仔鼠的空间记忆能力也有明显损伤作用。
　　3、饮水铅暴露可明显抑制早期发育阶段仔鼠海马中GS、GLAST和GLT-1的表达，并导致GS活性下降。

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结果

讨论

结论

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参考文献

综述 铅暴露对海马组织中Glu代谢影响的研究进展

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