间质细胞源性因子-1受体拮抗剂AMD3100对颞叶癫痫异常神经发生的调控作用

摘要

癫痫是最常见而严重的神经系统疾病之一，已被世界卫生组织列入全球重点防治的五大神经精神疾病。流行病学调查显示，在我国癫痫患病率高达7‰，我国现有900万以上癫痫患者，而且还以每年新发40万-60万例的速度递增。经正规抗癫痫药物治疗，大多数病人的癫痫发作可得到控制，但仍有20-30％的病人癫痫难以控制，最终发展为难治性癫痫，其中60％-70％为颞叶癫痫。颞叶癫痫以自发的反复痫性发作，认知障碍和抑郁为其特征，是最常见的难治性癫痫类型。海马异常的神经发生是颞叶癫痫模型的一个显著特征，包括苔藓纤维芽生，颗粒细胞门区异位迁移，门区基底树突，突触重组等，这些病理变化被认为对大脑异常活动起到促进作用。在颞叶癫痫的急性期齿状回的神经发生增强，而在慢性期神经发生则明显地减低。这可能与新生细胞在急性期和慢性期所处的微环境的改变有关。间质细胞源性因子-1(Stromal cell-derived Factor1，SDF-1)是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白，在生理状态下SDF-1与其特异性受体CXCR4高度表达在侧脑室下区及齿状回颗粒细胞层下区这两个脑内主要的神经发生区域。近来有研究发现成年脑内的神经干细胞也表达SDF-1/CXCR4。当SDF-1与CXCR4受体结合后，与CXCR4相连的G蛋白被激活，并进一步激活下游的信号传导途径，从而使细胞骨架发生改变，引起神经干细胞迁移、黏附，并调节神经干细胞的增殖和分化。在癫痫、中风等形式的脑损伤后，主要由死亡或受损的神经细胞、活化的胶质细胞及内皮细胞释放的SDF-1通过与CXCR4受体结合，能够吸引神经干细胞迁移到细胞变性、死亡区域及炎症区域。如果能够改变癫痫后新生神经细胞所处的微环境，从而调控异常的神经发生，可能会对癫痫尤其是难治性癫痫的治疗起到更积极的作用。我们通过侧脑室注射海人酸致颞叶癫痫模型观察了CXCR4拮抗剂AMD3100对海马异常神经发生的影响。
　　实验方法:
　　1、实验动物的分组:采用雄性Wistar大鼠，体重200-250g，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分为6组:急性期:(1)假手术组(n=5);(2)癫痫组(n=5);(3) AMD3100组(n=5)。慢性期:(1)假手术组(n=5);(2)癫痫组(n=5);(3) AMD3100组(n=5)。
　　2、颅内注射KA制作颞叶癫痫模型:采用颅内注射海人酸(kainic acid，KA)的方法制作颞叶癫痫模型。根据大鼠脑解剖图谱，用立体定位的方法将KA注射到大鼠侧脑室制作模型。
　　3、微量渗透泵颅内给药:在造模后第1天或第61天，用立体定位的方法在颈部皮下埋置灌注AMD3100的微量渗透泵，进行侧脑室内持续给药，连续7天。
　　4、5-嗅脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine，BrdU)示踪标记:在造模后第8天或第72天，向腹腔内注射BrdU100mg/kg标记神经干细胞，每天2次，间隔12小时，连续2天，最后一次注射后24小时取材。
　　5、组织切片的制备:以上各组动物分别于造模后第10天或第74天用多聚甲醛灌注固定，取脑，用恒冷切片机行连续脑冠状冰冻切片(片厚50μm)。
　　6、免疫荧光染色:用免疫荧光法观测大鼠海马齿状回DCX、BrdU、DCX/BrdU阳性细胞并测定海马门区异位迁移的颗粒细胞数及树突发育情况。
　　7、共聚焦显微镜成像:在共聚焦显微镜下获取海马齿状回区域DCX阳性细胞的Z轴方向系列图层后，对新生神经细胞树突及轴突进行三维重建，然后使用NIHImageJ软件对树突、轴突及其分支进行追踪描绘与测量，以观察DCX阳性细胞的树突发育成熟情况。
　　8、行为学测试:应用Morris水迷宫实验对大鼠学习记忆功能进行定量评价。
　　9、脑电图记录:在造模后第72天进行脑电图描计，观察各组大鼠痫性发作频率及平均持续时间。
　　10、统计学处理:实验数据以均值±标准差表示。数据分析采用统计分析软件SPSS17.0 for windows进行。应用单因素方差分析或重复测量方差分析来判断差异的统计学意义。
　　实验结果:
　　1、AMD3100对颞叶癫痫急性期海马齿状回神经细胞增殖的影响。癫痫组大鼠海马齿状回DCX、DCX/BrdU阳性细胞数目较假手术组明显地增加(P＜0.01)，AMD3100组大鼠海马齿状回DCX、DCX/BrdU阳性细胞数目较癫痫组明显减少(P＜0.01)。
　　2、AMD3100对颞叶癫痫慢性期海马齿状回神经细胞增殖的影响。癫痫组大鼠海马齿状回DCX、DCX/BrdU阳性细胞数目较假手术组减少(P＜0.01)，AMD3100组大鼠海马齿状回DCX、DCX/BrdU阳性细胞数目较癫痫组明显减少(P＜0.01)。
　　3、AMD3100对颞叶癫痫急性期新生神经细胞异位迁移的影响。癫痫组海马门区的DCX阳性细胞数显著多于假手术组(P＜0.01)，AMD3100组大鼠海马门区DCX阳性细胞数较癫痫组明显减少(P＜0.01)。
　　4、AMD3100对颞叶癫痫慢性期新生神经细胞异位迁移的影响。癫痫组海马门区的DCX阳性细胞数显著多于假手术组(P＜0.01)，AMD3100组大鼠海马门区DCX阳性细胞数较癫痫组明显减少(P＜0.01)。
　　5、AMD3100对颞叶癫痫急性期齿状回颗粒细胞树突发育的影响。癫痫组大鼠海马齿状回颗粒细胞的项树突及基底树突长度显著长于假手术组(P＜0.01)，AMD3100组大鼠海马齿状回颗粒细胞的项树突及基底树突长度较癫痫组明显减少(P＜0.01)。
　　6、AMD3100对颞叶癫痫慢性期齿状回颗粒细胞树突发育的影响。癫痫组大鼠海马齿状回颗粒细胞的顶树突及基底树突长度显著长于假手术组(P＜0.01)，AMD3100组大鼠海马齿状回颗粒细胞的顶树突及基底树突长度较癫痫组明显减少(P＜0.01)。
　　7、AMD3100对颞叶癫痫慢性期大鼠学习记忆功能的影响与假手术组相比，癫痫组的逃避潜伏期明显延长(P＜0.01)，而穿越平台次数明显减少(P＜0.01)。AMD3100组与癫痫组相比，逃避潜伏期有所缩短，穿越平台的次数增多，但两组间差异并没有统计学意义(P＞0.05)。
　　8、AMD3100对颞叶癫痫慢性期大鼠痫样放电的影响。癫痫组大鼠脑电图可以记录到持续存在散在发作的棘波。AMD3100组大鼠脑电图棘波出现的频率及每次出现持续的时间均明显减少(P＜0.01)。
　　结论:
　　1、AMD3100抑制了颞叶癫痫大鼠急性期与慢性期大鼠海马齿状回神经干细胞的增殖。
　　2、AMD3100抑制了颞叶癫痫大鼠急性期与慢性期新生神经细胞向海马门区的异位迁移。
　　3、AMD3100抑制了颞叶癫痫大鼠急性期和慢性期新生神经细胞树突的发育。
　　4、AMD3100减少了颞叶癫痫大鼠慢性期痫性放电的频率及每次发作持续时间。
　　5、AMD3100没有明显改善颞叶癫痫大鼠的学习记忆功能。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 间质细胞源性因子-1受体拮抗剂AMD3100对颞叶癫痫大鼠异常神经发生的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 间质细胞源性因子-1受体拮抗剂AMD3100对颞叶癫痫大鼠痫性放电及学习记忆功能的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 颞叶癫痫后神经发生的研究进展

在学期间科研成绩

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