Pdx1、Ngn3和MafA共转染大鼠肝细胞转分化成为胰岛素分泌细胞的实验研究

摘要

研究背景及目的
　　糖尿病已经成为严重威胁人类健康的最主要疾病之一，全球糖尿病患者已超过2亿人，并将于2025年达到4亿人。目前治疗1型糖尿病主要依赖于注射胰岛素，这却并不能阻止慢性血管病变的发展，且有发生低血糖等并发症的危险。2000年埃德蒙顿方案实施以来，胰岛移植被认为是治疗1型及部分重症2型糖尿病的理想方法。但是，胰岛移植临床应用也受到许多因素限制，其中最主要障碍是人供胰严重短缺。寻找可替代胰岛β细胞并且能够提供胰岛素分泌功能的移植供体，是当前研究的热点。
　　而细胞核重编程技术的出现，为寻找替代胰岛β细胞的研究提供新的希望。细胞核重编程指的是细胞内的基因表达由一种类型变成另一种类型。通过这一技术，可以在同一个体上将较容易获得的细胞类型转变成另一种较难获得的细胞类型。在这个领域的一个新的进展就是将胰腺的外分泌细胞直接转变成内分泌细胞。在这个研究当中，用腺病毒转入三个通常为胰岛β细胞分化所需的转录因子胰腺-十二指肠同源框1(pancreaticduodenalhomeobox1，Pdx1)、神经元素3（neurogenin3，Ngn3）和肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(v-mafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologueA，MafA)后，就成功转染的胰腺外分泌细胞转变成能产生胰岛素的细胞。Slack等构建了一个腺病毒载体Ad-PNM，同时包含小鼠Pdx1、Ngn3和MafA基因的编码序列在同一的转录单元，这样既可以保证实验细胞同时接受上述的三个基因，同时也可以简化操作步骤。应用此载体，Slack等人成功的将大鼠胰腺外分泌细胞系AR42j-B13转化为胰岛素分泌细胞。
　　在个体发育过程中，肝脏和胰腺都起源于前肠末端，发育上的同源性提示肝脏和胰腺在细胞增殖和分化调控等方面有很高的相似性，这就为肝脏来源的细胞转分化为胰岛β细胞提供可能性。目前已有证据表明，有些胰腺发育相关的转录因子可将肝原始细胞、成熟的肝细胞，甚至肝肿瘤细胞诱导分化为可分泌胰岛素的胰岛细胞样细胞。考虑到肝细胞的易获得性，肝细胞转化胰岛素分泌细胞的研究将会为临床应用带来更好的前景。
　　同时肝细胞是人体重要的一类细胞，主要能够合成白蛋白等血浆蛋白、参与胆汁合成、脂类代谢、糖代谢以及蛋白加工等。另外，肝特异性的转录因子还参与到胰岛素合成和分泌过程。因而，研究在转分化的胰岛素分泌细胞内这些肝特异性基因和肝特异性转录因子是如何变化，既可进一步明确转分化的详细机制，又可以明确与胰岛素合成和分泌相关的基因的改变情况，为进一步完善改造胰岛素分泌细胞提供实验依据
　　方法
　　(1)采用脂质体转染法将包含有Pdx1、Ngn3和MafA编码区域的Ad-PNM质粒转染大鼠肝细胞BRL3A，并低糖培养基中使其转分化成为胰岛素分泌细胞。以Ad-GFP转染的细胞作为对照。倒置显微镜观察转染前，转染后细胞第1、3、5和7天形态变化;采用生长曲线法观察增殖能力变化情况。采用流式细胞术鉴定转染效率。RT-PCR法检测转染后胰岛素分泌细胞内外源性小鼠Pdx1、Ngn3和MafA，大鼠Pdx1、Ngn3和MafA，大鼠Ins1和Ins2基因的表达。采用Real-TimePCR法定量检测转染前及转染后第1、3、5和7天的细胞内Insulin的相对表达量。采用免疫荧光检测转染后第1、3、5和7天的细胞内Pdx1、Ngn3、MafA和insulin蛋白的定位。采用Elisa法检测转染前及转染后第1、3、5和7天的细胞内的胰岛素含量以及分泌量。(2)采用免疫荧光检测转染后胰岛素分泌细胞内albumin和insulin蛋白的定位。分别采用Real-TimePCR和WesternBlot定量检测转染后胰岛素分泌细胞内肝特异性基因(Alb、Glul和Factor(Ⅹ))和肝特异性转录因子（HNF1α、HNF3α、HNF6、LRH-1和C/EBP-β）的表达改变情况。
　　结果
　　(1)转染包含有Pdx1、Ngn3和MafA编码区域的Ad-PNM质粒后转染后6hr即可观察到细胞由正常状态下的椭圆形变成扁平的类似于成纤维细胞的形状。整细胞体积变小，细胞浆变少，细胞核变小且不清晰。1d后这种转变有所改善，部分细胞体积较6hr时明显增大，细胞核清晰。而到3d时，大部分细胞重新变回或接近椭圆形，仅有少部分细胞仍为类似于成纤维细胞的形态。转染后胰岛素分泌细胞增殖能力明显低于未转染的细胞(P＜0.05)。流式细胞术显示转染后24hr有95.13±1.05％细胞的表达Pdx1蛋白荧光信号，说明转染效率良好。转染后24hr即可检测到外源性小鼠来源Pdx1，Ngn3和MafA基因的mRNA水平表达，而内源性大鼠Pdx1基因的mRNA始终没有检测到。在转染后3d，可以检测到大鼠胰岛素基因Ins1和Ins2的mRNA表达。在转染后第3天，可以观测到胰岛素分泌细胞内的insulin在mRNA水平表达。Elisa法转染前细胞内几乎检测不到胰岛素，而转染后细胞内可以检测到胰岛素，并在转染后第5天达到最高值，与细胞内总蛋白相比为81.97±3.10pg/μg。转染前细胞没有胰岛素分泌能力，无论是在高糖或是低糖条件下。而转染后细胞可以检测到分泌到培养液中胰岛素，但在不同葡萄糖浓度条件下检测到的胰岛素含量没有统计学差异，说明转染后得到的胰岛素分泌细胞并没有根据葡萄糖浓度调节胰岛素分泌的功能。(2)部分转染后胰岛素分泌细胞可于胞浆中检测出Insulin的表达，而相对应的这些细胞内Albumin的表达出现下调或者消失。转染后第5天Alb、Glul和FactorⅩ基因在mRNA和蛋白水平的表达对比未转染前的表达水平有不同程度的下降(P＜0.05)。与肝脏特异性基因表达均下调不同，肝脏特异性转录因子HNF1α、HNF3α和HNF6在转染后出现表达上调(P＜0.05)，而转录因子Lrh1和C/EBP-β的表达水平明显下调(P＜0.05)。
　　结论
　　(1)Pdx1、Ngn3和MafA成功的将大鼠肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞。(2)转分化后的胰岛素分泌细胞能分泌一定量的胰岛素，但并不能够根据葡萄糖浓度进行而调节胰岛素分泌量。(3)转分化的胰岛素分泌细胞内肝特异性基因和转录因子存在明显改变，其中Alb、Glul、FactorⅩ、转录因子LRH-1和C/EBP-β的表达明显下调，而转录因子HNF1α、HNF3α和HNF6的表达上调。

目录

声明

摘要

论文一 Pdx1、Ngn3和MafA共转染大鼠肝细胞转分化成为胰岛素分泌细胞的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 转分化的胰岛素分泌细胞内肝脏特异性基因表达改变的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

文献综述 胰岛素分泌细胞的建立及研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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