氢氧化钙抑制牙髓卟啉单胞菌脂多糖骨破坏作用研究

摘要

目的：
　　牙髓卟啉单胞菌（porphyromonas endodontalis，P.e）作为急性根尖周病损的特异性检出菌，与牙髓病和根尖周病的发生发展有着密切联系，在菌体增殖或死亡时其胞壁释放出主要毒力因子-脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可以刺激成骨细胞分泌多种炎症因子并最终导致骨质吸收。氢氧化钙（Calcium hydroxide，CH）作为临床最常用的根管消毒药物，因可解离出羟基离子而呈强碱性，对根尖周病的多种厌氧菌具有较强的抑制及杀灭作用，但由于革兰氏式阴性厌氧菌在死亡时会崩解出LPS贴附于根管壁及根管侧枝甚至于溢出根尖周，以继续发挥促炎及骨破坏作用，所以氢氧化钙对革兰氏阴性厌氧菌的LPS活性有无良好的抑制作用值得深入研究。本实验旨在研究P.e LPS对成骨细胞及破骨细胞的作用，并检测氢氧化钙是否可以抑制P.e LPS对骨组织的破坏作用。
　　材料和方法：
　　1、细菌培养和LPS的提取与鉴定
　　将P.e接种于脑心浸液（Brain heart infusion）固体培养基，在37℃、厌氧条件下（含80％N2、10％CO2、10％H2）培养。采用热酚水法提取P.e LPS，应用凝胶鲎试剂对所提取的脂多糖进行定性分析。
　　2、氢氧化钙溶液的制备
　　将200 mg氢氧化钙干粉溶于50 ml三蒸水中，剧烈震荡10 min后，1000 g离心10 min，收集上清液，经直径0.22μm的滤器过滤后，以此做为氢氧化钙母液(体积分数为100％)，备用。
　　3、细胞培养
　　小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7生长于含10％胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素的MEM-α的培养基中，置于含5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。选择生长良好的对数期细胞，进行实验。
　　4、P.e LPS活性分析
　　用去热源水将P.e LPS浓度倍比稀释为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8μg/ml，各浓度组加入15％氢氧化钙溶液，对照组加入等体积的去热源水，于37℃孵育6h（将氢氧化钙与P.e LPS作用6h后的混合液记为CH-P.e LPS），显色基质法鲎试验检测P.e LPS的活性。
　　5、细胞活性分析
　　MC3T3-E1细胞接种于96孔板，密度为2×103个/孔。分别加入氢氧化钙、P.e LPS及CH-P.e LPS作用细胞1、3、5d后，MTT法检测细胞活性。
　　6、RNA提取及反转录PCR(RT-PCR)分析
　　氢氧化钙与P.e LPS在体外37℃下作用2、6、18及24h后，再将二者混合液加入MC3T3-E1细胞作用6h，到达作用时间后，使用Trizol（Invitrogen）提取细胞总RNA，使用RT-PCR(Takara)试剂盒行反转录及PCR，检测IL-6和TNF-αmRNA的表达。
　　7、免疫荧光
　　MC3T3-E1细胞计数后接种在盛有无菌玻片(直径为18mm)的培养皿内过夜生长，制取细胞爬片。加入P.e LPS及CH-P.e LPS作用30 min，3.7％的甲醛固定细胞，NF-κB抗体于4℃下孵育过夜，二抗孵育40 min，封片后于荧光显微镜下检测。
　　8、Western blot分析
　　将P.e LPS及CH-P.e LPS加入MC3T3-E1细胞作用30 min，使用凯基蛋白提取试剂盒分离细胞核蛋白及胞质蛋白，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，4℃孵育NF-κB抗体过夜，二抗孵育4h，ECL试剂盒检测NF-κB蛋白表达。
　　将P.e LPS及CH-P.e LPS加入RAW264.7细胞作用6、24或36h，裂解细胞，抗NFATc1抗体4℃孵育过夜，二抗孵育4h，ECL试剂盒检测NFATc1蛋白表达。将P.e LPS及CH-P.e LPS加入RAW264.7细胞作用30或60 min，裂解细胞，p-p38、p38、p-ERK和ERK抗体4℃孵育过夜，二抗孵育4h，ECL试剂盒检测p-p38、p38、p-ERK和ERK的表达。
　　9、荧光素酶检测
　　NF-κB报告基因质粒转染MC3T3-E1细胞或RAW264.7细胞，孵育4h后，将培养液更换为含10％胎牛血清的MEM-α的培养液孵育24 h，加入P.e LPS及CH-P.e LPS作用细胞1h，采用Dual-Glo(R) Luciferase试剂盒检测NF-κB荧光素酶活性。
　　10、抗酒石酸酸性磷酸酶检测
　　P.e LPS或CH-P.e LPS作用RAW264.7细胞4d，室温下将RAW264.7细胞用梓檬酸盐/丙酮溶液固定30s，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，光镜观察抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞（≥5个核）。
　　向出生3d的Balb/c小鼠头盖骨区域连续注射超纯水、氢氧化钙、P.e LPS及CH-P.e LPS12 d，处死小鼠，解剖分离头盖骨，用梓檬酸盐/丙酮溶液固定头盖骨30s，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，观察头盖骨染色饱和度。
　　11、微型计算机断层成像(μCT)
　　小鼠头盖骨的药物注射同上，解剖分离头盖骨，固定，采用μCT分析骨密度，并进行三维重建。
　　12、Masson-Goldner三色法染色和组织学分析
　　小鼠头盖骨的药物注射同上，解剖分离头盖骨，将分离的头盖骨用石蜡包埋，制成4μm切片，Masson-Goldner试剂盒行三色法染色，显微镜下观察头盖骨的组织学变化。
　　13、统计学分析
　　所有实验数据以平均数±标准差的形式记录，每次实验至少重复3次。建立数据库，进行ANOVA统计分析，统计学差异标记为*(P＜0.05)和**(P＜0.01)。
　　结果：
　　1、P.e LPS活性及纯度分析
　　凝胶鲎试验结果显示最小浓度10 ng/ml P.e LPS即具有内毒素活性，且所提取的P.e LPS无蛋白及核酸污染。
　　2、氢氧化钙抑制P.e LPS活性
　　不同浓度的P.e LPS与15％氢氧化钙体外37℃作用6h后，活性均显著下降。
　　3、氢氧化钙消除P.e LPS对成骨细胞活性的抑制
　　10μg/mlPeLPS作用MC3T3-E1细胞1、3、5d后，细胞活性逐渐下降，若10μg/ml P.e LPS与15％氢氧化钙作用6h后(CH-P.e LPS)，则不再抑制MC3T3-E1细胞活性。
　　4、氢氧化钙抑制P.e LPS介导的成骨细胞炎症反应
　　(1)、P.e LPS作用MC3T3-E1细胞6h后，IL-6和TNF-α mRNA表达量显著增加;若P.e LPS与15％氢氧化钙体外作用2、6、18、及24 h再加入MC3T3-E1细胞作用6h，则IL-6和TNF-α mRNA表达量逐渐下降
　　(2)、P.e LPS作用MC3T3-E1细胞30 min，引起NF-κB的核移位及细胞核内NF-κB蛋白表达的升高;若CH-P.e LPS加入MC3T3-E1细胞作用30 min，则无明显NF-κB的核移位及细胞核内NF-κB蛋白的表达。
　　(3)、P.e LPS作用MC3T3-E1细胞1h，NF-κB的荧光素酶活性显著升高，相比之下，CH-P.e LPS作用MC3T3-E1细胞1h，NF-κB的荧光素酶活性相对下降。
　　5、氢氧化钙抑制P.e LPS介导的破骨细胞生成
　　(1)、P.e LPS作用RAW264.7细胞4d，破骨细胞生成显著增加;若CH-P.e LPS作用RAW264.7细胞4d，破骨细胞生成相对下降。
　　(2)、P.e LPS作用RAW264.7细胞6、24及36h，NFATc1蛋白表达量升高且于24 h达到高峰;若CH-P.e LPS作用RAW264.7细胞6、24及36h，NFATc1蛋白表达量在各时间点都相对下降。
　　(3)、P.e LPS作用RAW264.7细胞1h，NF-κB荧光素酶活性升高;若CH-P.eLPS作用RAW264.7细胞1h，NF-κB的荧光素酶活性相对下降。
　　(4)、P.e LPS作用RAW264.7细胞30或60 min，p-p38和p-ERK蛋白表达量增加;若CH-P.e LPS作用RAW264.7细胞30或60 min，p-p38和p-ERK蛋白表达量都相对下降。
　　6、氢氧化钙抑制P.e LPS介导的骨破坏
　　(1)、连续12d向小鼠头盖骨区域注射P.e LPS或CH-P.e LPS，P.e LPS促进了头盖骨破骨细胞生成，CH-P.e LPS则相对抑制了破骨细胞生成。
　　(2)、P.e LPS显著降低了头盖骨区域的骨密度，导致骨质破坏;CH-P.e LPS则相对增加了头盖骨区域的骨密度，抑制了骨质破坏。
　　(3)、P.e LPS降低了头盖骨骨层厚度，导致骨细胞减少;CH-P.e LPS则相对增加了骨层厚度、未矿化骨质增多。
　　结论：
　　1、氢氧化钙逆转P.e LPS对成骨细胞增殖的抑制作用。
　　2、氢氧化钙抑制P.e LPS对成骨细胞NF-κB的激活，减弱P.e LPS刺激细胞表达IL-6和TNF-α炎症因子的能力。
　　3、氢氧化钙抑制P.e LPS对单核/巨噬细胞NF-κB、p38、ERK通路的激活及NFATc1的表达，减弱P.e LPS诱导单核/巨噬细胞分化成破骨细胞的能力。
　　4、氢氧化钙抑制P.e LPS介导的小鼠头盖骨骨密度的降低、消除了P.e LPS导致的骨质破坏。

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结论

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参考文献

综述 氢氧化钙在根管消毒中的作用机制

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