中国MSM人群CRF59-01B的鉴定及其特点的研究

摘要

目的：
　　艾滋病是目前对人类社会威胁最大的传染性疾病之一。尽管联合抗病毒药物已经普遍应用于艾滋病的治疗，但由于HIV-1存在高水平的遗传变异性，同时在人体免疫应答和抗病毒药物的作用下，病毒易出现高突变、高重组现象，从而使HIV在全球范围内经历了复杂的起源和流行过程。目前，HIV-1可以分为4个组，即M组(Main)、O组(Outlier)和N组(Non-M-Non-O)以及P组的，其中M组已经进化为十一种亚型和亚亚型，61种流行重组型(Circulating RecombinantForms，CRFs)以及难以计数的独特重组型（Unique Recombinant Forms，URFs），并且已有许多URFs转变为CRFs。现阶段，我国MSM(Men Who have Sex With Men，MSM)人群中流行的HIV-1毒株主要是CRF01_AE Cluster1和Cluster2、CRF07_BC Cluster3、B/B'亚型及CRF55_01B等多种亚型共流行的局面，这种现象为不同亚型或流行重组型之间发生重组提供了机会。同时，MSM人群HIV疫情正处在快速上升阶段，并且该人群是我国传播的重要桥梁人群，已经成为我国艾滋病防治的重点对象。了解和掌握我国MSM人群HIV-1毒株亚型的流行状况及其进化特点，是艾滋病防治及研究的基础，并能为认识HIV流行规律、设计艾滋病疫苗、研发诊断试剂及药物研发提供科学的依据。
　　本研究于2008年至2013年在全国十一个省份收集920例MSM人群HIV-1感染者血浆样本，扩增1.1 kb pol(pro-RT)区基因片段，通过pol(HXB2:2253-3318)基因片段进化树分析，对疑似流行重组型的样本，采用5'半分子和3'半分子两段法单基因扩增并直接测序的方法(Single Genome Amplifieation andSequeneing，SGA/S)获得血浆病毒HIV几乎近全长基因(Near Full Length Genome，NFLG)序列，确认该人群中存在一新型的重组株:CRF59_01B。从病毒全基因组水平分析CRF59_01B的重组模式;采用时间进化分析(BEAST v.1.6.0)，分析其不同片段的起源时间;结合流行病学数据，推算其流行规模，明确其在我国MSM人群总体流行状况，并分析其对未来我国MSM人群HIV流行可能的影响，从而为我国HIV-1感染的预防、诊断、监测和治疗提供重要的数据支持。
　　材料和方法：
　　一、研究对象
　　2008年至2013年全国11个省份招募920例MSM人群HIV-1感染者，吉林8例;辽宁263例;北京163例;山东42例;江苏49例;上海26例;安徽136例;河南58例;湖南68例;广东40例;云南67例。HIV感染者的EDTA抗凝血浆样本均由上述各省疾病控制中心采集，同时收集HIV感染者的流行病学资料。血浆样本于-80℃.冻存。所有患者均签署知情同意书，并经过了中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。
　　二、血浆样本RNA的提取
　　使用140ul EDTA抗凝外周静脉血血浆，采用QIAamp RNAMini试剂盒，按照试剂盒说明书标准方法，快速提取HIV-1全基因组RNA60μl。将纯化后的RNA置-80℃保存备用或进行一下步试验。
　　三、pol区扩增及NFLG逆转录
　　1.1 kb pol区扩增体系基于TaKaRaTaqTMDR001 AM一步法说明;NFLG逆转录反应体系基于SuperScript(R)Ⅲ Reverse Transcriptase Kit（invitrogen）说明书，分5'半分子和3'半分子两段逆转录，分别获得5'半分子和3'半分子cDNA。
　　四、SGA方法Nested-PCR扩增NFLG
　　本实验采用Nudease Free Water倍比稀释cDNA(1∶3;1∶9;1∶27可适当优化)的方法，每个稀释度均做8个平行孔，进行套式PCR扩增，直至扩增阳性孔少于3个。根据Possion分布，当阳性率小于25％时，即可认为每个孔为单一模板扩增产物。PCR扩增体系基于Platinum(R)Taq DNA Polymerase High Fidelity Kit（Invitrogen）说明书，分两段套式扩增HIV-1 cDNA全长基因组序列。
　　五、测序及序列分析
　　选取每个样本的第二轮产物各50ul，由北京博迈德测序公司，使用Primerwalking测序。测得的序列用Vector NTI8.0软件包中的ContigExpress组件将每个样本NFLG的5'半分子和3'半分子序列拼接为一个完整的近似全长基因组。用Bioedit(vision3.3)对拼接序列进行编辑、校正、合并样本序列和参考毒株序列为一个队列。用MEGA5.1软件以Kimura双参数方法构建pol和全长Neighbor-Joining系统进化树。使用HIV Database的在线软件RIP: RecombinantIdentification Program和jpHMM: jumping profile Hidden Markov Model(www.hiv.lanl.gov)初步分析基因序列的重组状况。使用软件Simplot(v3.5.1)对重组毒株的断点进行准确定位。
　　六、CRF59_01B最近共同祖先的推断
　　使用Bayesian Evolution Analysis Sampling Trees(BEAST v1.5.4)软件推断最近共同祖先形成时间(tMRCA)。用BioEdit5.0将比对好的序列文件转换为.nex文件，用BEAUTi v1.5.4软件打开.nex文件，选择运行参数，Markov chain Monte Carlo(MCMC)运算:2×108次，生成.xlm文件。运行BEAST v1.5.2，打开生成的.xml文件，运算并保存结果至.log文件和.trees文件。用Tracer v1.4打开.log文件，分析tMRCA值;用FigTree1.3.1打开新生的.tree文件，得到MCC树。
　　结果：
　　一、我国MSM人群HIV-1亚型分布
　　通过构建1.1 kb pol进化树分析，本研究获得的920例样本中共发现六种明确的病毒亚型，占到总亚型的96.9％，CRF01_AE占57.9％(533/920)，CRF07_BC占24.2％(233/920)，B亚型占11.0％(101/920)，B'亚型占1.2％(11/920)，CRF08_BC占0.4％(4/920)，CRF33_01B占0.1％(1/920)，CRF55_01B占2.1％(19/920);而且，CRF01_AE又进一步分为两簇:Cluster1和Cluster2，而大部分的CRF07 BC也独立成簇，为我国MSM人群的Cluster3。各种URFs28例，占3.1％(28/920)。
　　二、28例URFs重组情况的研究
　　使用Mega5.0构建28例URFs序列Neighbor-Jioning基因系统进化树，发现在28例URFs当中，有6例明显在一个进化簇上，Simplot分析皆为CRF01AE/B，重组断点几乎一致。本实验获得6条1.1 kb pol CRF01_AE/B分别通过5'半分子和3'半分子SGA方法，扩增测序得到5条NFLG，全长基因序列为9kb左右。利用MEGA(V5.0)软件Neighbor-joining tree法，构建5条近似全长序列进化树，5条序列仍明显独立成簇，各患者之间未有明确的流行病学关联。依据HIV Database序列命名原则，本研究发现的5条NFLG及1条1.1 kb pol序列命名为CRF59_01B。且本研究结果已被Genebank和HIV Database数据库收录。
　　三、我国MSM人群CRF5901B重组断点分析
　　运用Simplot软件进行全基因组精确重组断点断位。通过作图发现，CRF59_01B共有四个重组断点，四个重组断点分别位于pol区的2570和2719(相对于HXB2位置)以及vpu-env区的6149和8244(相对于HXB2位置)，把整个CRF59_01B全基因组分成五个部分，其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ部分为CRF01_AE，Ⅱ、Ⅳ部分为B，即:Ⅰ(HXB2:790-2569)=CRF01_AE;Ⅱ(HXB2:2570-2718)=B;Ⅲ(HXB2:2719-6148)=CRF01_AE;Ⅳ(HXB2:6149-8243)=B;Ⅴ(HXB2:8244-9600)=CRF01_AE。整个基因组序列又以CRF01_AE为骨架，分别在pol区和vpu-env插入部分B亚型毒株序列。
　　四、CRF59_01B全基因组各亚区(Subregion)来源的研究
　　依据Simplot软件对CRF59_01B重组断点的精确划分结果，分别对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ构建Subregion进化树，发现Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ部分的CRF01_AE亚型亲本来源于泰国CRF01_ AE，并非我国MSM人群中所特有的CRF01_AE Cluster1和Cluster2;而Ⅱ、Ⅳ部分的B亚型亲本来源于早期MSM人群中流行的欧美B亚型，不是中原地区有偿采供血爆发流行的B'亚型。
　　五、CRF59_01B起源时间及传入MSM人群时间的推算。
　　运用BEAST程序，我们分别分析CRF59_01B的CRF01_AE亚型成分和B亚型成分起源时间。研究结果表明，CRF01_AE亚型成分和B亚型起源时间几乎一致，分别为2000.8(1998.0-2002.9)和2001.2(1995.4-2005.8)，可以推测CRF59_01B起源时间大约为2001年，而后开始在MSM人群流行传播。
　　结论：
　　一、我国MSM人群有多种HIV-1毒株流行，主要流行毒株为CRF01_AEC luster1和Cluster2、CRF07_BC、B/B'、CRF55_01B、CRF59_01B及各种URFs。其中，B/B'、CRF55_01B、CRF59_01B及各种URFs呈现低流行趋势。
　　二、首次在我国MSM人群中鉴定出一株CRF59_01B。
　　三、明确了CRF59_01B在我国MSM人群流行规模及流行率:0.7％，并推算出其在我国MSM人群中的起源时间:2001年。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

附录 综述 我国MSM人群中HIV-1流行重组型(CRFs)和独特重组型(URFs)研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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