人巨细胞病毒成分在中枢神经系统相关肿瘤中表达的研究

摘要

研究背景
　　近年来，随着人口增长及人口老龄化，中枢神经系统肿瘤的发病率及死亡人数呈上升趋势。中枢神经系统肿瘤约占全身肿瘤的5％，占儿童肿瘤的70％，在美国，每年新发神经系统肿瘤18000例，患者死亡人数达12000例[1]。中枢神经系统肿瘤又以脑胶质瘤发病率高，由于预后不良，缺乏彻底治疗办法，所以对其研究从未间断。肿瘤病因复杂，而病毒是诱发人类肿瘤的重要因素，人巨细胞病毒可能就是其中之一。人巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus，HCMV)是一种广泛传播的β疱疹病毒，也是一种常见的线状双链DNA病毒，它是人类重要的致畸、致神经损伤病原体，与弓形虫、风疹病毒、单纯疮疹病毒、梅毒螺旋体一起，并称为人类五大生物致畸因子。HCMV在人群感染率较高，我国是世界上HCMV先天性感染发病最高的国家之一，在普通人群中的感染率为80％以上，对于某些特殊地区和人群，其感染率可高达100％[2]。HCMV具有潜伏活动的生物学特性，人感染HCMV后，常终身带毒，免疫功能正常时，感染常无症状，病毒潜伏持续存在[3]。
　　近年来越来越多的研究发现在脑胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤中存在HCMV的感染。Cobbs等[4]首次报道27例不同级别脑胶质瘤组织中（Ⅱ-Ⅳ级）表达HCMV基因组和蛋白产物，并且在脑胶质瘤中具有高表达率。随后Mitchell等[5]于2008年也报道90％以上胶质母细胞瘤组织中可检测到HCMV基因组和蛋白质，且80％胶质母细胞瘤患者外周血中可检测到HCMV基因组，而对照组均为阴性，这些均显示HCMV感染与胶质瘤发生、发展存在一定联系。
　　一般认为HCMV对宿主细胞的影响是HCMV感染后，通过激活细胞内的原癌基因C-myc、C-jun等以及增加细胞内的第二信使，引起Ca2+释放，促进细胞内DNA、RNA和蛋白质的合成。HCMV通过细胞周期中的相关细胞因子变化以及p53、磷酸化Rb等其他细胞周期调节蛋白来上调cyclinE、cyclinE-CDK2复合物功能或失控，使细胞强行通过G1/S期检查点，干扰细胞有丝分裂，导致细胞周期功能失调;而发生在S期的HCMV感染则导致细胞周期阻滞，使细胞增殖异常，从而促进肿瘤发生。此外，HCMV感染还可以改变机体细胞多种重要的调节途径，控制细胞分化、增殖、迁移、血管发生及DNA修复等，影响肿瘤进程[6]。
　　虽然越来越多的研究表明HCMV感染能够促进脑胶质瘤的生长，并对胶质瘤细胞的生物学行为产生一系列影响，但关于HCMV在肿瘤中的存在及其对肿瘤的相关作用仍存在争议。Sabatier和LauSK等[7，8]研究显示胶质瘤组织中不存HCMV基因组和蛋白产物;而HCMV在脑膜瘤、垂体瘤、海绵状血管瘤和脑转移癌中的表达情况国内外尚无相关研究报道。本课题探讨HCMV与中枢神经系统相关肿瘤的关系，可丰富对神经相关肿瘤病因学及发病机制的认识，并有利于寻找更多有效的疾病诊断方法及发现新的靶向性治疗途径，对防治因HCMV感染所致肿瘤具有重要意义。
　　目的
　　1、验证HCMV成分在脑胶质瘤中的表达情况，探讨HCMV成分表达水平与肿瘤恶性程度和患者预后的关系。
　　2、检测HCMV成分在非胶质性中枢神经系统肿瘤中的表达情况。
　　方法
　　一、标本来源
　　2007年1月至2009年12月中国医科大学附属第一医院神经外科手术切除且保存完整的中枢神经系统肿瘤，包括67例脑胶质瘤，65例脑膜瘤（良性、非典型性和恶性），45例垂体瘤，20例海绵状血管瘤和30例脑转移癌组织标本，6例对照组标本来自于原发性癫痫病灶切除术后脑组织。胶质瘤的组织学诊断根据2007年WHO中枢神经系统肿瘤分级标准，同时手术进行前，我们留取了该67例脑胶质瘤患者及6例原发性癫痫患者的外周血，并保存在-80℃冰箱中。
　　回顾性收集脑胶质细胞瘤病人医疗记录中的临床病理因素，包括年龄，性别，术前KPS评分，肿瘤大小，肿瘤级别，肿瘤切除程度等。肿瘤体积通过术前MRI扫描进行计算:长×宽×厚度×1/2。无进展生存期(PFS)的定义，从手术日期到第一次磁共振证实复发或死亡的，以两者先发生者为准。本研究经过我院的伦理委员会批准，并符合赫尔辛基公约标准，每个病人都签署了知情同意书。
　　二、免疫组化方法检测HCMV蛋白产物IE1-72和pp65在中枢神经系统肿瘤中的表达情况。
　　4μm中枢神经系统相关肿瘤切片在68℃烤20分钟，二甲苯脱蜡和水化后，切片浸入乙二胺四乙酸或柠檬酸缓冲液中进行高温高压抗原修复，然后经过3％过氧化氢，灭活内源性过氧化物酶，山羊血清封闭。抗人HCMVIE1-72和pp65抗体，4℃孵育过夜。根据免疫组化试剂盒说明，辣根过氧化物酶标记的二抗聚合物在室温下孵育20分钟，DAB显色，苏木素复染后封片。染色结果在光学显微镜下观察并拍照分析。
　　三、巢式PCR方法检测HCMVDNA在中枢神经系统肿瘤中的扩增情况。
　　DNA分别从20mg新鲜冰冻组织中和300μl全血中提取，根据试剂盒说明书进行DNA提取，提取后通过超微量分光光度计测定。扩增体系为25μl，外引物扩增反应体系与条件如下:组织DNA2μl，上游外引物0.5μl(10mM)，下游外引物0.5μl(10mM)，Taq酶0.5U，加无菌双蒸水至25μl。将反应管置于PCR仪中扩增，参数设置如下:94℃5min变性，以后每个循环中94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环35次，最后延伸72℃6min。内引物扩增反应体系与条件如下:外引物扩增产物2μμl，上游内引物0.5μl(10mM)，下游内引物0.5μl(10mM)，Taq酶0.5U，加无菌双蒸水至25μl。将反应管置于PCR仪中扩增，参数设置如下:94℃5min变性，以后每个循环中94℃30s，59℃30s，72℃30s，循环40次，最后延伸72℃5min。5μlPCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶下电泳100V30min，紫外灯下观察，凝胶成像系统照相。
　　四、统计学分析
　　所有定量数据用平均值±标准差表示，采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。构建Cox回归模型，多因素分析HCMV成分表达水平与脑胶质瘤病人无进展生存期的关系。用Kaplan-Meier方法构建生存曲线，对数秩检验log-rank进行检验。采用x2检验计算各组之间的差异，以P＜0.05认为有显著性差异，有统计学意义。
　　结果
　　一、HCMV成分在脑胶质瘤中的表达
　　脑胶质瘤组织中HCMV蛋白产物IE1-72免疫组化染色阳性率为76.1％(51/67)，pp65阳性率为65.7％(44/67)，蛋白主要定位于细胞核和（或）细胞质中。脑胶质瘤组织及患者外周血中HCMV基因在巢式PCR的阳性率分别为52.2％(35/67)和29.9％(20/67)，HCMV蛋白产物及基因组在6例对照组中无阳性表达，两者结果比较有统计学意义(P＜0.05)。
　　二、HCMV蛋白表达水平与脑胶质瘤恶性程度的关系
　　51例(76.1％)出现HCMVIE1-72蛋白免疫反应阳性组织中，其中17例(77.3％)Ⅱ级星形细胞瘤、18例(69.2％)Ⅲ级星形细胞瘤和16例(84.2％)胶质母细胞瘤中出现阳性表达。同时，44例(65.7％)细胞核和（或）细胞质中出现HCMVpp65蛋白阳性表达组织中，其中13例(59.1％)Ⅱ级星形细胞瘤、16例(61.5％)Ⅲ级星形细胞瘤以及15例(78.9％)胶质母细胞瘤组织中出现阳性表达。不同级别脑胶质瘤中HCMVIE1-72和pp65蛋白表达差异没有统计学意义。
　　三、HCMV成分表达水平与脑胶质瘤患者的预后关系
　　我们使用单因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存分析，评估67例脑胶质瘤病人。通过单变量和多变量分析结果表明，肿瘤恶性程度是脑胶质瘤病人无进展生存期的一个重要的独立危险预后因素（风险比[HR]=1.731，95％置信区间[CI]=1.270-2.358，P=0.001），而HCMV蛋白基因表达水平却不是一个重要的独立危险预后因素。同时我们使用Kaplan-Meier生存分析方法，发现HCMV蛋白基因表达水平与脑胶质瘤患者的PFS无相关性，它们的表达水平不能看做一个能预测患者预后的生物标志物。
　　四、HCMV成分在非胶质性中枢神经系统肿瘤中的表达
　　通过免疫组化技术我们检测到3.1％(2/65)的脑膜瘤出现HCMVIE1-72蛋白阳性表达，4.6％(3/65)的脑膜瘤出现HCMVpp65阳性表达，而在非典型性及恶性脑膜瘤中未出现两种蛋白的阳性表达。另外，6.7％(2/30)的转移癌出现HCMVIE1-72蛋白阳性表达，但无HCMVpp65蛋白的阳性表达。在垂体瘤和海绵状血管瘤组织中也未检测到HCMVIE1-72和pp65蛋白的表达。通过巢式PCR技术对上述结果得到了进一步验证。
　　结论
　　1、HCMV蛋白产物及基因在脑胶质瘤组织中出现较高的阳性表达，而在对照脑组织中没有表达，从而证实脑胶质瘤中存在HCMV感染，并说明HCMV感染在脑胶质瘤的发生发展中起到一定的作用。
　　2、HCMV蛋白基因表达水平与脑胶质瘤的病理级别和患者的预后无直接相关。
　　3、HCMV感染并不是脑胶质瘤的一个特殊现象，在中枢神经系统其它相关肿瘤中也出现HCMV成分低比率表达，通过对两者结果详细比较可能阐明HCMV在中枢神经系统肿瘤中的相关作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 人巨细胞病毒成分在脑胶质瘤中表达的研究及临床意义

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 人巨细胞病毒成分在非胶质性中枢神经系统肿瘤中表达的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 HCMV感染与肿瘤相关性的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简历