限制性内切酶BamHI及具有外切酶活性的phi29DNA聚合酶有滚环扩增中的应用

摘要

核酸作为重要的生物大分子之一，以一种遗传信息的形式在生物体内发挥各种功能，是从亲代向子代传递信息的物质基础。核酸的合成、切割、连接、变构、修饰等众多反应在细胞生命进程中无时不在，这对于维持正常基因组的复制及修复、实施基因表达的调控具有重要的意义。许多酶也参与了各种细胞生命进程，这些酶具有独特的酶活性，比如聚合酶、内切酶、连接酶、外切酶等，它们在基础研究和应用研究中的应用非常广泛。
　　传统的酶活性检测方法为琼脂糖凝胶电泳、亲和力分析、高效液相色谱以及酶联免疫吸附测定。这些方法具有连续性差、灵敏度低、检测过程长以及人工参与多等缺点。在本研究中，我们使用以荧光共振能量转移为原理的方法对限制性核酸内切酶进行测定。限制性内切酶切割DNA在生命活动中是十分常见的生物学事件。然而核苷酸衍生物对限制性内切酶的影响尚不清楚。我们利用荧光共振能量转移的方法对2'-甲氧基核苷酸和2'-氟代核苷酸对限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ的酶切效率的影响进行研究。
　　生命科学的高速发展需要先进的核酸分析和检测技术以完成高灵敏度和高特异性的检测，而传统的检测方法往往难以实现。滚环扩增是新兴的一种体外核酸扩增技术。它只需在常温下进行，操作简单易行。此外，以G-四链体为基本框架的化学发光可视化检测也日益受到了人们的关注。
　　在本文，我们首先对滚环扩增中所用的phi29 DNA聚合酶进行了研究。Phi29DNA聚合酶链具有5'-3'聚合酶特性以及3'-5'外切酶校读功能。我们利用phi29DNA聚合酶的3'-外切酶活性对靶核酸片段上3'末端的非互补序列进行剪切，考察不同长度的非互补序列对滚环扩增效率的影响，并成功地对含有G2677T/A核苷酸序列进行了SNP检测。
　　其次，我们利用G-4 DNA和hemin构建了DNAzyme检测体系，利用核苷酸衍生物对环形模板实施保护，对滚环扩增的长链产物进行了酶切处理，对DNAzyme的形成条件进行了优化，实现了可视化检测。
　　材料与方法:
　　1、圆二色谱分析:
　　利用JASCO-810型圆二色光谱仪(JASCO，Japan)用来测定样品在溶液中所形成的二级结构特征曲线。
　　2、紫外吸收及熔解曲线分析:
　　利用紫外分析仪（Varian cary300型）检测修饰与未修饰双链的稳定性，测定Tm值等相关参数，考察修饰后双链的稳定性是否对酶切实验有影响。
　　3、荧光共振能量转移分析:
　　利用荧光共振能量转移实验(fluorescence resonance energy transfer, FRET)分析甲氧基核苷酸和氟代核苷酸对底物进行修饰后对限制性核酸内切酶的影响。并计算了两个重要的动力学参数——Vmax和Km。
　　4、DNAzyme方法:
　　G-4 DNA能够与氯化血红素结合形成具有过氧化物酶活性的模拟酶复合物，可催化H2O2氧化2，2-吖嗪双（3-乙基-7-苯并噻唑啉磺酸）二铵盐(ABTS)，从而使体系的颜色发生变化。
　　实验结果:
　　1、BamHI的酶浓度与酶切反应初速度之间具有良好的线性关系。2'-甲氧基核苷酸（2'-OMeNA）对BamHI识别序列GGATCC修饰的酶切阻滞效应均具有位点依赖性。2'-甲氧基核苷酸修饰BamHⅠ-T4位点的底物抑制酶切反应，而G1、C5和C6位点修饰的底物可以促进酶切反应。
　　2、BglⅡ的酶浓度与酶切反应初速度之间具有良好的线性关系。2'-甲氧基核苷酸(2'-OMeNA)对BglⅡ识别序列AGATCT修饰的酶切阻滞效应也具有位点依赖性。2'-甲氧基核苷酸修饰BglⅡ-T4位点底物仍可阻滞酶切反应，A1和A3位点修饰的底物可促进酶切反应。
　　3、2'-氟代核苷酸修饰时，BamHI和BglⅡ的各个修饰底物无一例外地阻碍酶切反应，只是阻滞程度不同。
　　4、在滚环扩增反应中，2'-甲氧基核苷酸修饰BamHI-T4位点可以保护环形模板，但是BamHI仍然可以剪切在滚环扩增过程中产生的长链DNA成为短链，使得剪切产物能够形成G-四链体，为DNAzyme的检测信号得到实现。
　　5、利用phi29 DNA聚合酶的外切酶活性，可以对靶核酸片段上3'末端的非互补序列进行剪切，对滚环扩增效率不产生太大的影响。
　　结论:
　　1、利用2'-甲氧基核苷酸或2'-氟代核苷酸对内切酶底物进行修饰，可以使限制性核酸内切酶BamHI及Bg/Ⅱ发生不同的酶切效应。2'-甲氧基核苷酸修饰底物可以调节限制性核酸内切酶BamHI的活性，有助于在合成生物学中用于构建新的生物系统。
　　2、在滚环扩增中，2'-甲氧基核苷酸修饰的底物可以保护环状模板不被切割。但是不影响对DNA底物的正常切割，从而实现了对滚环扩增产物的切割，可以使得剪切产物能够形成G-四链体，形成DNAzyme，实现对靶核酸片段的可视化检测。
　　3、具有外切酶活性的phi29 DNA聚合酶可以切除靶核酸片段3'末端的错配碱基，并可以继续滚环扩增，实现对G2677T/A的检测。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

论文一 核苷酸衍生物对BamHI及BglⅡ的酶切效率影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 限制性内切酶BamHI及具有外切酶活性的phi29 DNA聚合酶在滚环扩增应用中的初步探索

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 滚环扩增在核酸检测的应用进展

在学期间科研成绩

致谢

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