慢性乙醇暴露诱导神经胶质细胞凋亡及美金刚对其抑制作用的研究

摘要

目的
　　近年来，慢性乙醇中毒的病患有增多趋势，引起了世界医学界和社会学界的高度重视。慢性乙醇中毒是长期过量饮酒引起的中枢神经系统严重中毒，有报道显示慢性乙醇中毒能产生永久的认知功能障碍，从而被认为是影响人类健康的重要因素。乙醇对脑组织有较强的亲和力，所以慢性乙醇中毒对脑神经细胞的损害尤为严重。在生理条件下，通过反复饮酒而非某一次饮酒促使血脑屏障功能障碍和神经损害。慢性乙醇中毒具体机制还尚未明确，有研究表明，慢性乙醇中毒发病机制与神经细胞凋亡有关。乙醇能造成许多神经症状，如昏迷、共济失调、酒精戒断症状及神经兴奋毒性，这些都与N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid，NMDA)受体有密切联系。NMDA受体是中枢神经系统中重要的兴奋性谷氨酸受体，同时也是中枢神经系统细胞膜上重要的离子门控通道，其是由三类亚基(NR1、NR2、NR3)组成的异聚体，NMDA受体主要通过NR1及NR2发挥生物学功能，NR1亚基是NMDA受体的功能亚基。NMDA受体对乙醇高度敏感，是乙醇主要靶受体之一。NMDA受体过度激活使神经细胞内Ca2+超载，Ca2+是重要的第二信使，能激活许多酶产生复杂的反应，从而启动细胞凋亡程序，最终导致神经细胞损害。神经胶质细胞（星形胶质细胞）是乙醇作用的靶细胞之一，在神经系统中其数量巨大，具有支持、营养等基本功能，在神经发生、突触可塑性、突触传递及其信息整合等方面也具有十分重要的作用。神经胶质细胞发生凋亡的同时必将殃及神经元细胞，继而导致神经元细胞的坏死和凋亡。NMDA受体拮抗剂可降低Ca2+通道的通透性从而预防Ca2+内流，被认为具有神经保护作用，是神经变性病的潜在治疗药物。1-氨基-3，5二甲基金刚烷胺盐酸盐(memantinehydrochloride，美金刚)是一种新型、低中度亲和力、电压依赖、非竞争性NMDA受体拮抗剂。本实验使用H4细胞慢性乙醇暴露模型，应用细胞活力测定、细胞凋亡检测、细胞内平均钙离子浓度检测、Western-blot等技术检测慢性乙醇暴露下H4细胞NR1蛋白表达变化，探讨慢性乙醇暴露下H4细胞凋亡机制及美金刚对慢性乙醇暴露下的H4细胞是否具有保护作用。
　　实验材料与方法
　　培养H4细胞，分别暴露在含有不同浓度(25mM、50mM、100mM)乙醇的培养液中1d、3d、5d、7d，以DPBS溶剂作为空白对照(con)。通过细胞Hoechst染色、MTS活力检测、细胞凋亡检测、细胞内平均游离钙离子浓度([Ca2+]i)检测、Westernblot等技术观察H4细胞的生长增殖变化、存活率变化、凋亡率变化、细胞[Ca2+]i变化及NR1蛋白表达变化。观察在含有不同浓度乙醇培养液中同时加入NMDA受体非竞争性抑制剂美金刚后，H4细胞的死亡（凋亡）是否被抑制。
　　结果
　　H4细胞在慢性乙醇暴露下，部分细胞漂浮，贴壁细胞数减少。Hoechst染色发现H4细胞肿胀，细胞核大部分出现畸形、溶解、聚集等凋亡特征性改变。通过检测H4细胞在不同时间、浓度乙醇暴露下的存活率和凋亡率，发现1d、3d、5d各浓度乙醇暴露组细胞存活率和凋亡率变化不明显，而乙醇7d暴露组随着乙醇暴露浓度的增高，细胞存活率下降、凋亡率升高。相同浓度乙醇7d暴露组与同时加入美金刚的乙醇7d暴露组相比，细胞存活率增高、凋亡率下降。通过检测不同时间、浓度乙醇暴露下细胞[Ca2+]i，发现相同浓度乙醇暴露组3d时细胞[Ca2+]i最高，随后开始下降。Western-blot技术检测不同时间和浓度乙醇暴露组H4细胞NR1蛋白表达，发现乙醇1d、3d、5d暴露组随着乙醇浓度增高，NR1蛋白表达增高，而7d暴露组随着乙醇浓度增高，NR1蛋白表达降低。在相同浓度乙醇暴露组中，5d时NR1蛋白表达量最高，加美金刚的乙醇5d暴露组NR1蛋白表达量明显低于单纯乙醇5d暴露组。
　　结论
　　1、慢性乙醇暴露能诱导H4细胞凋亡;
　　2、慢性乙醇暴露下H4细胞NR1表达会发生变化，其中乙醇5d暴露组NR1表达量最高，各实验组NR1表达整体呈先增高后降低的趋势，且其变化具有时效和量效相关性;
　　3、慢性乙醇暴露诱导H4细胞[Ca2+]i变化，其中乙醇3d暴露组最高，各实验组整体呈先增高后降低的趋势，且其变化具有时效和量效相关性;
　　4、美金刚对于慢性乙醇暴露诱导的H4细胞凋亡有抑制作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 慢性乙醇暴露诱导胶质细胞凋亡机制研究进展

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