自噬在三阴性乳腺癌细胞紫杉醇耐药中作用及机制的研究

摘要

目的:
　　三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体（HER2）均阴性的一种特殊类型乳腺癌。因缺乏内分泌治疗及抗HER2分子靶向药物治疗的靶点，目前针对TNBC明确有效的全身治疗方法仍以化疗为主。但是在TNBC治疗过程中化疗药物耐药现象较为常见，严重影响TNBC的治疗效果。自噬作为一种细胞内物质再循环的过程，能够清除肿瘤细胞内因化疗药物所导致的毒性未折叠蛋白质和受损细胞器，并提供能量，进而对肿瘤细胞起到保护作用。本研究利用高度模拟临床化疗过程的间歇刺激法建立三阴性乳腺癌MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系，检测耐药细胞自噬水平变化，并在此基础上进一步研究自噬在紫杉醇耐药中发挥的作用及机制。另外，本研究也检测紫杉醇耐药细胞对表柔比星和顺铂两种化疗药物敏感性变化情况，明确是否存在的交叉耐药的发生。
　　方法:
　　本研究利用间歇刺激法筛选三阴性乳腺癌MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系。将耐药细胞与亲本细胞对比，检测经紫杉醇处理后乳腺癌细胞生存、增殖和凋亡变化。利用磺酰罗丹明B比色法，测定乳腺癌细胞对紫杉醇的IC50值、台盼蓝法测定生存率、BrdU法检测增殖率、流式FITC AnnexinⅤ法检测凋亡，及Westernblot法检测凋亡相关蛋白cleaved Caspase3和cleaved PARP。另外，利用Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表达，免疫荧光法测定LC3Ⅱ荧光斑点数，对比分析紫杉醇耐药细胞及其亲本细胞的自噬水平。利用自噬抑制剂spautin-1和慢病毒转染shRNA抑制自噬相关基因FIP200、Atg13表达的方法抑制细胞自噬水平，观察抑制自噬对乳腺癌细胞紫杉醇敏感性的调节作用。利用MitoTracker Green FX、MitoTracker Red CMXRos标记乳腺癌细胞内总线粒体及功能正常线粒体，流式细胞仪检测细胞损伤线粒体比率，进一步研究自噬在紫杉醇耐药中发挥作用的分子机制。最后对比分析紫杉醇耐药细胞和亲本细胞对表柔比星和顺铂敏感性差异。
　　结果:
　　（一）间歇刺激法成功建立MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系
　　10个周期紫杉醇间歇刺激处理后，所获得MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系231P对紫杉醇的IC50值为2.3 nmol/L，是亲本细胞231N对紫杉醇IC50值0.37nmol/L的6倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。紫杉醇作用下231P生存率增高，凋亡减低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。紫杉醇对细胞增殖抑制结果显示，尽管在正常状态下231P的增殖略低于231N，但是在紫杉醇作用下，231N和231P增殖均被明显抑制至相似水平。上述结果证明231P对紫杉醇的耐药能力较亲本细胞231N显著增高。
　　（二）紫杉醇耐药乳腺癌细胞基础自噬水平显著提高
　　利用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ变化、免疫荧光法检测自噬荧光斑点数，研究结果证实在正常培养条件下，231P的基础自噬水平较231N显著提高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　（三）抑制自噬导致紫杉醇介导细胞凋亡增加
　　利用自噬抑制剂spautin-1和基因抑制（shRNA）抑制自噬相关基因FIP200、Atg13表达，有效地抑制乳腺癌细胞自噬水平。紫杉醇作用下细胞克隆形成实验显示，自噬抑制后231N和231P对紫杉醇的敏感性增强，克隆形成能力显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。抑制自噬相关基因FIP200、Atg13表达导致紫杉醇作用下231P生存率减低，凋亡率增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　（四）自噬水平的上调增强紫杉醇耐药乳腺癌细胞损伤线粒体的清除能力
　　正常培养状态或紫杉醇处理后231P中损伤线粒体比率小于231N，差异具有统计学意义(P＜0.05)，使用自噬抑制剂spautin-1处理后，231N和231P损伤线粒体比率均增加至相似水平，两者间无统计学差异。基因抑制(shRNA)抑制自噬相关基因FIP200、Atg13表达后，在正常培养状态和紫杉醇处理后231P损伤线粒体比率显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　（五）紫杉醇耐药乳腺癌细胞出现对表柔比星和顺铂的交叉耐药
　　与231N比较，在表柔比星或顺铂作用下231P的生存率增高，凋亡率减低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示紫杉醇耐药细胞231P对表柔比星和顺铂出现一定程度的交叉耐药。
　　结论:
　　本研究利用间歇刺激法成功建立三阴性乳腺癌MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系，并发现紫杉醇耐药细胞基础自噬水平较亲本细胞显著提高。上调的自噬水平提高了紫杉醇耐药细胞对损伤线粒体的清除能力，抑制紫杉醇诱导细胞凋亡发生，对紫杉醇耐药细胞起到保护作用。抑制自噬能够增加耐药细胞对紫杉醇敏感性。另外，紫杉醇耐药细胞对表柔比星和顺铂产生一定程度的交叉耐药。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 三阴性乳腺癌MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系的建立及自噬水平检测

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 自噬上调抑制紫杉醇介导乳腺癌细胞凋亡的发生

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 紫杉醇耐药乳腺癌细胞清除损伤线粒体的能力在自噬调控下增强并发生交叉耐药

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 自噬在肿瘤治疗中的作用

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致谢

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