PTSD中缝背核ERS分子伴侣GRP78及跨膜蛋白ATF6α通路应答UPR的实验研究

摘要

创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder，PTSD)指的是对战争等严重应激源的一种心理、生理异常反应，其在临床上的核心症状主要有反复重现创伤性体验、警觉性增高、持续性回避及认知、情绪的负性改变。近些年随着自然灾害、重大交通事故及社会暴力等事件的不断增多，PTSD发生率也不断上升，并逐渐成为影响我国人口素质及经济发展的沉重社会负担，颇得国内外高度关注。尽管目前对PTSD开展了大量研究，但其确切发病机制至今尚不十分清楚。大量临床及药理学研究报道，PTSD患者血浆及大脑中缝背核(Dorsal raphe nucleus)5-羟色胺（5-HT）水平较健康人群显著降低，而给予5-HT重摄取抑制剂(SSRIs)可显著改善PTSD患者症状。这表明大脑中缝背核5-HT系统参与了PTSD的发病，大脑中缝背核功能失调是引起PTSD的可能发病机制之一。
　　我们前期研究证实PTSD大鼠中缝背核神经元存在钙稳态调节相关蛋白质如钙调蛋白、钙调蛋白激酶等表达异常，而内质网(endoplasmic reticulum，ER)是细胞内钙储存及蛋白质合成的重要场所，当细胞发生钙离子平衡紊乱、蛋白质合成障碍等异常时，可引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。这启发我们ERS-UPR可能参与了PTSD发病，是导致PTSD中缝背核功能失调的重要机制。
　　葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein78，GRP78)是内质网内的分子伴侣，在ERS-UPR的启动中发挥了重要作用。在非应激状态下，GRP78与ATF6α等3个内质网应跨膜蛋白相结合，协助蛋白质的正确折叠与转运;发生ERS时，GRP78与跨膜蛋白解离并启动UPR各信号通路以缓解应激、恢复内质网内环境稳态。而若刺激强度过大、持续时间过长，UPR不能有效缓解ERS时，UPR信号通路将最终上调CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)等内质网应激特异性转录因子、启动细胞凋亡以清除受损细胞。
　　目的：
　　大量文献研究证实ERS-UPR机制参与了许多疾病的发生发展，如脑缺血缺氧、糖尿病、阿尔茨海默病等，但至今为止PTSD发病中ERS-UPR应答情况的研究较少见，且处于起步阶段。本研究采用国际公认的PTSD动物模型即单一延长应激(single prolonged stress，SPS)模型，通过免疫组织化学、Western blot、逆转录PCR(RT-PCR)、透射电镜等技术以探讨PTSD中缝背核分子伴侣GRP78与跨膜蛋白ATF6α通路对UPR的应答，以期为揭示PTSD的发病机制提供实验依据。
　　实验方法：
　　一、PTSD中缝背核ERS分子伴侣GRP78应答UPR的实验研究
　　将Wistar大鼠随机分为正常对照组与模型组。模型组采用单一连续刺激(singleprolonged stress，SPS)方法建立PTSD大鼠模型，并随机分为SPS刺激后1d、7d和14d组。采用透射电镜技术观察PTSD大鼠中缝背核神经元内质网形态学改变，并采取免疫组织化学SABC法、Western blot方法检测PTSD大鼠中缝背核神经元内质网应激标志性分子伴侣GRP78及GRP94表达。
　　二、PTSD中缝背核ERS跨膜蛋白ATF6α信号转导的实验研究
　　将Wistar大鼠随机分为正常对照组与模型组。模型组采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，并随机分为SPS刺激后1d、7d和14d组。采用免疫组织化学SABC法、Western blot方法检测ATF6α蛋白表达;采用RT-PCR方法检测ATF6α及其下游靶基因XBP1、GRP94 mRNA改变。
　　三、PTSD中缝背核CHOP与细胞凋亡的实验研究
　　将Wistar大鼠随机分为正常对照组与模型组。模型组采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，并随机分为SPS刺激后1d、7d和14d组。采用免疫组织化学、Westernblot方法检测CHOP蛋白表达;采用RT-PCR技术观察CHOPmRNA改变;采用透射电镜技术观察中缝背核神经元细胞核形态学改变。
　　结果：
　　一、PTSD中缝背核ERS分子伴侣GRP78应答UPR的实验研究
　　1、PTSD大鼠中缝背核神经元内质网形态学改变
　　SPS刺激后第7d组大鼠中缝背核神经元内质网腔出现了扩张改变。
　　2、GRP78、GRP94免疫组化分析结果
　　GRP78、GRP94的免疫阳性表达呈棕黄色颗粒，主要定位于胞浆中。SPS刺激后GRP78、GRP94阳性表达量较正常对照组明显增加(P＜0.01)，尤其以SPS刺激后第7天显著(P＜0.01)，随后稍微降低，但也显著较正常对照组增多(P＜0.01)。
　　3、GRP78、GRP94 Western blot检测结果
　　SPS刺激后GRP78蛋白显著增加，7d时表达最多，之后逐渐减少，但仍明显高于正常对照组(P＜0.01)。GRP94蛋白表达变化趋势与GRP78一致，SPS刺激后逐渐表达增加，7d达峰值，随后降低。
　　二、PTSD中缝背核ERS跨膜蛋白ATF6α信号转导的实验研究
　　1、ATF6α免疫组化分析结果
　　ATF6α蛋白定位在胞浆，阳性表达呈棕黄色。经SPS刺激后第1d，ATF6α阳性表达稍有增多，随后逐渐减少，尤以SPS刺激后第14d显著减少(P＜0.01)。
　　2、ATF6α Western blot检测结果
　　ATF6α(p90 ATF6α)是定位于内质网膜上的跨膜蛋白，分子量为90kDa。经SPS刺激后第7d、第14d p90 ATF6α表达明显减少(P＜0.01)。而在50kDa区域，出现清晰条带(p50 ATF6α)且表达量持续增多(P＜0.01)。
　　3、ATF6α RT-PCR检测结果
　　经SPS刺激后，ATF6α mRNA未见明显改变(P＞0.05)。
　　4、XBP1、GRP94 RT-PCR检测结果
　　经SPS刺激后第1d，XBP1 mRNA有显著增多(P＜0.01)，随后逐渐减少。GRP94 mRNA在SPS刺激后表达上调，在第7d达峰值(P＜0.01)，之后降低。
　　三、PTSD中缝背核CHOP与细胞凋亡的实验研究
　　1、免疫组织化学检测结果
　　经SPS刺激后CHOP阳性表达较对照组显著增多(P＜0.05)，尤以SPS刺激后第14d显著增多(P＜0.01)
　　2、Western blot检测结果
　　CHOP在正常大鼠中缝背核神经元表达低下，而经SPS刺激后，CHOP表达明显增多(P＜0.05)，尤其以SPS刺激后第14d显著增多(P＜0.01)。
　　3、RT-PCR检测结果
　　正常组CHOP mRNA表达量相对较少;而经SPS刺激后，CHOP mRNA逐渐增多(P＜0.05)，尤以SPS刺激后第14d显著(P＜0.01)。
　　4、透射电镜检测结果
　　经SPS刺激后，中缝背核神经元细胞核出现染色质边集、半月状改变。
　　结论：
　　1、SPS使中缝背核神经元内质网出现扩张，GRP78及GRP94表达上调。
　　2、SPS能激活ATF6α，并上调其下游靶基因XBP1、GRP94 mRNA表达。
　　3、SPS能上调中缝背核CHOP表达，并使神经元发生早期凋亡改变。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 PTSD中缝背核ERS分子伴侣GRP78应答UPR的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 PTSD中缝背核ERS跨膜蛋白ATF6α信号转导的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 PTSD中缝背核CHOP与细胞凋亡的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新的自我评价

参考文献

综述 创伤后应激障碍(PTSD)与中缝背核5-HT系统在其发病中作用的研究进展

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