纳米羟基磷灰石聚醚醚酮对成骨细胞MG63增殖分化的影响及其机制的研究

摘要

目的:
　　当今社会，由于肿瘤术后及外伤等造成骨缺损的病人越来越多，尤其是颌面部骨缺损严重影响美观和功能，因此，人们对生物医用骨替代材料的需求日益增加。在临床上常用的骨替代材料是金属，然而，一些显著的缺点阻碍了其更广泛的医疗应用[1]。其高强度和弹性模量与正常人骨组织不匹配，可造成植入体周围骨出现应力遮挡效应，这将导致相邻的骨组织吸收，引起假体松动。金属的射线不透性会导致计算机断层摄影(CT)图像出现伪影和检查患者的磁共振成像(MRI)的能力受到限制。羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)的主要化学成分是Ca10(PO4)6(OH)2，与人类骨组织成分的无机物相似。具有极好的生物相容性，生物活性。其机械强度比人类骨皮质差。在这方面，有必要使用一个高性能聚合物与HA进行复合，以提高其机械性能。聚醚醚酮(Polyetheretherketone，PEEK)是最早由一群英国科学家于1978年[2]开发的一种半结晶性的线性多环芳香族热塑性塑料。其具有稳定的化学和物理性质[3]:它是耐磨和在耐高温的;它能抵抗除了浓硫酸外的所有药物的攻击[4]，在灭菌过程中它仍然稳定[5]。更重要的是，聚醚醚酮的机械性质与人体皮质骨接近[6]。Bakar等[7]曾尝试将羟基磷酸钙填料加入聚醚醚酮，使聚醚醚酮表面具有生物活性。羟基磷酸钙粉体粗大和用量高，严重减低了聚醚醚酮材料的机械强度。与传统的微米级填料系统不同，均匀分散于聚合物之中的纳米填料能在单位体积内产生超大的界面积。这种超大界面积以及填料本身的纳米尺度能使聚合物纳米复合材料在获得新的性能的同时，其力学性能也得到显著提高[8-9]。将纳米级别的HA与PEEK复合，并且引入类似偶联剂SPEEK，克服HA的缺陷，集中两种材料的优势，以便更好适应临床需要。目前该材料与MG63细胞特征性蛋白的研究未见报道，本实验采用实验室制备的纯的PEEK、纯的HA、SPEEK/PEEK、10％HA/SPEEK/PEEK四种材料与MG63细胞共培养，检测材料对该细胞生物学特性可能造成的影响，体外评价该材料的细胞相容性，同时，本文深入研究10％HA/SPEEK/PEEK浸提液培养MG63细胞后，经典的wnt通路的是否作用，为该材料的应用和临床研究提供科学依据。
　　实验方法:
　　1、浸提液制备
　　PEEK、SPEEK/PEEK、HA、10％HA/SPEEK/PEEK，均有深圳大学提供，粉末状态。所有四组样品均于50ml离心管中，用无血清RPMI-1640培养基重悬材料，配成浓度为8mg/ml的混悬液，浸泡48h后过滤灭菌，加入10％胎牛血清，用于后续细胞培养。制成浸提液备用。
　　2、细胞培养
　　复苏后的MG63细胞加入培养基，在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下静置培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，2-3天换液，细胞长至80％融合时，进行传代。
　　3、实验材料分组
　　实验组:PEEK、SPEEK/PEEK、HA、10％HA/SPEEK/PEEK;
　　对照组:空白对照。
　　4、流式细胞仪检测
　　浸提液制备，细胞培养同前，各组分别加入4种材料培养基2ml，空白组加正常培养基，分别培养48h后进行细胞周期检测。离心，去上清，乙醇固定。PBS清洗;RNase A水浴;PI染色。联机检测。
　　5、Real Time RT-PCR法检测
　　MG63细胞培养方法同前，培养后14天、21天、28天，样本总RNA提取，反转录，得到对应的cDNA，电泳分析，Exicycler TM96荧光定量仪检测MG63细胞内ALP和COLI的表达情况。
　　6、wnt3a持续作用后，免疫荧光检测β-catenin蛋白
　　爬片4％多聚甲醛固定，tritonX-100孵育，封闭。一抗孵育，二抗孵育，DAPI复染，抗荧光淬灭剂封片，镜检。
　　7、wnt3a持续作用后，Western-Blotting检测β-catenin蛋白
　　收集Wnt3a连续培养21d与空白培养21d的MG63细胞，提取细胞总蛋白，电泳后，转印，封闭，孵育一抗，孵育二抗。曝光、显影、定影。
　　8、wnt3a持续作用后，RT-PCR检测wnt3a信号下游靶向基因表达情况:
　　细胞培养同前，wnt3a持续作用MG63细胞7天、14天、21天，样本总RNA提取，反转录，得到对应的eDNA，电泳分析，Exicycler TM96荧光定量仪检测MG63细胞内c-myc和cyclin D1的基因表达情况。
　　9、统计学分析
　　Real-time RT-PCR所得的结果，单因素方差加配对t检验法分析蛋白和基因指标统计。使用SPSS14.0软件进行统计学分析。所有的检测数据，至少重复3次，p＜0.05被认为有统计学意义。
　　实验结果:
　　1、流式细胞仪检测:
　　四种浸提液中培养的MG63细胞，48小时后，均有稳定的增殖。10％HA/SPEEK/PEEK组增殖高于其他四组，差异有显著意义。SPEEK/PEEK组高于PEEK组，差异不显著。PEEK组和SPEEK/PEEK组增殖低于空白对照组，差异不显著;也低于纯的HA组，但差异显著。
　　2、Real Time RT-PCR法检测
　　(1)四种材料的浸提液培养MG63细胞14天、21天、28天，成骨细胞特征性的蛋白ALP、COLI的DNA的量表达明显。10％HA/SPEEK/PEEK组表达高于其他四组，差异有显著性。PEEK组和SPEEK/PEEK组增殖低于空白对照组，低于HA组，差异不显著。随着时间的延长各组的表达均有所下降。
　　(2)四种材料的浸提液培养细胞，wnt3a持续作用7天、14天、21天，与没有wnt3a作用的细胞对比，下游蛋白c-myc和cyclin D1的基因均有明显表达。14天和21天比7天时，基因表达增加，差异有显著意义。14天比21天时基因表达增加，但不显著。
　　3、免疫荧光显微镜形态学观察
　　10％HA/SPEEK/PEEK浸提液培养细胞21天，细胞增殖良好，多数细胞呈圆形或卵圆形，细胞核呈蓝色，卵圆形，核膜连续完整，大致位于细胞中央。目标蛋白β-catenin曾绿色荧光，卵圆形。wnt3a作用组可见绿色荧光大部分进入细胞核，且荧光强度高。而对照组，绿色荧光大部分在细胞膜上，进入细胞核的少。且绿色荧光弱。实验组β-catenin表达明显高于对照组。
　　4、Western-Blotting检测β-catenin蛋白
　　Western Blotting结果可以看出，wnt3a连续培养21 d的β-catenin蛋白条带明显比空白对照的蛋白条带粗。且颜色更重。
　　结论:
　　1、四种PEEK复合材料浸提液中MG63细胞均生长增殖良好。
　　2、四种浸提液中MG63细胞增殖期的特征蛋白ALP、Ⅰ型胶原均有表达，其中10％HA/SPPEK/PEEK浸提液组的蛋白表达最显著，其次是HA组，第三是SPPEK/PEEK组，最低是PEEK组。但随着时间的延长，表达均有所下降。28天比21天表达下降，但差异不显著。
　　3、wnt3a作用21天后，10％HA/SPPEK/PEEK浸提液中MG63细胞分泌的β-catenin蛋白显著增加，下游基因cyclinD1、c-myc表达显著增加，wnt通路开放。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 纳米羟基磷灰石聚醚醚酮对成骨细胞(MG63)增殖分化的影响

前言

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

论文二 纳米羟基磷灰石磺化聚醚醚酮对成骨细胞(MG63)增殖分化机制研究

前言

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 羟基磷灰石生物聚醚醚酮纳米复合材料的研究现状

在学期间科研成绩

致谢

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