神经肽SP对C57BL/6小鼠脾NK细胞迁移及趋化因子受体表达的影响

摘要

目的：
　　NK细胞主要存在于肝、脾、肺和外周血。NK细胞可以利用细胞因子效能和细胞毒活性，对机体炎症感染和抗肿瘤疾病免疫发挥关键性作用。NK细胞可以杀死炎症性、病原感染性以及肿瘤性细胞，这是经过不同种类的NK细胞表面受体发挥作用的。NK细胞可以表达不同功能和种类的受体，它们能够与其密切联系的细胞因子和趋化因子之间发生联系，以此来调节其向炎症感染以及肿瘤病灶等部位聚集、行使趋化能力或者进行其它生物学活动。
　　SP是一类神经肽物质，而神经肽是神经内分泌系统受到各种影响或者发挥作用反应时分泌的一类生物活性肽，其对机体进行各种免疫功能调节具有非常重要的调控作用。SP对机体免疫调节和免疫活动都有着很好的促进效应，是体内进行自身调节和防御机制必不可少的调节性多肽，它对机体中自然杀伤细胞的增殖能力和杀伤活性具备了双向作用功能。自然杀伤细胞在各种趋化性细胞因子及其受体影响下，可迁移到病变部位，发挥抵抗炎症感染和防御肿瘤侵害的免疫防御作用。通过研究SP对小鼠NK细胞迁移能力和趋化因子受体表达功能的影响，为研究SP对NK细胞作用机制提供了更多线索，并为抗肿瘤癌变、抗炎症感染及抗移植排斥等医疗活动提出新的策略。
　　方法：
　　1、C57BL/6小鼠脾脏NK细胞的提取分离。①实验用C57BL/6小鼠处死后，获取脾组织细胞悬液;②小鼠脾脏淋巴细胞分离，收集其中的白色悬浮层细胞;③Miltenyi MACS NK细胞分选，收集NK细胞。④测定分离纯化的NK细胞活性⑤NK细胞纯化率流式测定。
　　2、C57BL/6小鼠脾NK细胞吉姆萨染色以及荧光染色。①吉姆萨染色:NK细胞悬液涂布在载玻片;甲醇固定;吉姆萨液染色;显微镜观察并拍照。②荧光染色:NK细胞封闭液封闭;NK1.1抗体孵育;荧光显微镜观察拍照。
　　3、C57BL/6小鼠脾NK细胞迁移实验:Transwell法检测不同浓度SP（终浓度为0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）对C57BL/6小鼠脾NK细胞迁移的影响。
　　4、趋化因子受体mRNA表达的测定:不同浓度SP(终浓度为0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M)处理NK细胞6小时，Real-Time PCR检测各实验组趋化因子受体CCR5、CCR3、CXCR4的mRNA表达水平。
　　5、不同浓度SP（终浓度为0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）处理NK细胞6小时，流式细胞术检测C57BL/6小鼠NK细胞表面趋化因子受体CCR5、CCR3、CXCR4的表达情况。
　　6、不同浓度SP(终浓度为0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M)处理NK细胞24小时，流式方法测定各实验组NK细胞亚群变化。
　　结果：
　　1、C57BL/6小鼠脾NK细胞阴性分选后NK1.1阳性细胞率(％):83.00±1.91。
　　2、磁珠分选C57BL/6小鼠脾NK细胞经吉姆萨染色和苏木素染色:镜下可见圆形或椭圆形细胞，细胞核为椭圆形，有染色的嗜天青颗粒存在。磁珠分选C57BL/6小鼠脾NK细胞使用NK1.1荧光标记，镜下只见红色荧光的细胞。
　　3、在(10-14M～10-10M) SP浓度范围内，随着SP浓度的增加，其促进NK细胞迁移作用逐渐增强，达到峰值，其后，在(10-10M～10-6M) SP浓度范围内，随着SP浓度的增加，其促进NK细胞迁移作用逐渐减弱。
　　4、SP对3种趋化因子受体mRNA表达的影响不同。①CCR3在SP10-14M、10-12M浓度时，可明显促进其mRNA表达。②CCR5在(10-10M～10-6M) SP浓度范围内，可明显促进其mRNA的表达。③CXCR4在（10-14M～10-6M）SP浓度范围内，其均可明显促进其mRNA的表达。
　　5、SP对小鼠脾NK细胞表面趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR4表达的影响不同。①在(10-14M～10-6M) SP浓度范围内，阳性细胞表达逐渐下降。②在（10-14M～10-10M）SP浓度范围内，阳性细胞表达逐渐增加，10-10M浓度时，其达到峰值，在(10-10M～10-6M) SP浓度范围内，其阳性细胞表达逐渐下降。
　　6、流式检测不同浓度SP刺激NK细胞24小时，检测结果为不同浓度SP（终浓度为0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）影响C57BL/6小鼠脾NK细胞的亚群，增加CD27hiCD11blo、CD27hiCD11bhi、CD27loCD11bhi的阳性细胞百分率，降低CD27loCD11 blo阳性细胞百分率。
　　结论：
　　SP在一定浓度范围内促进C57BL/6小鼠脾NK细胞的迁移，增加表面趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR4的mRNA水平表达及表面趋化因子受体CCR5、CXCR4膜表达，其对NK细胞亚群变化的作用进一步表明SP对C57BL/6小鼠脾NK细胞的趋化迁移有影响。

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