香豆素类化合物花椒毒酚和补骨脂定在肝微粒体代谢的体外研究

摘要

目的：
　　研究发现，很多天然香豆素类化合物对CYP450酶的活性有影响，以抑制作用为主。花椒毒酚和补骨脂定是具有相似药理学活性的天然香豆素类化合物，两者是否对CYP450酶的活性有影响以及在体内外的代谢途径目前未见有报道。在本研究中，拟在对花椒毒酚和补骨脂定特点的理解和先期研究的基础上，明确花椒毒酚代谢起主要作用的CYP450酶、花椒毒酚代谢的动力学特征并探讨花椒毒酚对CYP450酶活性的影响及其可能机制，从而对该类化合物潜在的毒副作用进行早期预测提供依据;在不同种属中鉴定补骨脂定的代谢产物，阐明补骨脂定在体内的生物转化规律，从而为补骨脂定在体内发挥药效及毒副作用提供化学基础，也为进一步改造补骨脂定的化学结构提供依据，同时也能更好地了解补骨脂定代谢的种属差异，为补骨脂定动物模型的选择提供参考。
　　方法：
　　一、花椒毒酚在人肝微粒体中代谢
　　200μL的孵育体系，包括100 mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，NADPH-再生系统(1 mM NADP+，10mM葡萄糖-6-磷酸，1 U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，4mMMgCl2)，肝微粒(0.3 mg/mL)。在整个实验中，花椒毒酚连续稀释到所需浓度，体系中甲醇的终浓度少于1％(v/v)。在37℃预孵5min后，加入NADP+(1 mM，20此)起始反应，孵育30min后，加入200μL冰冷的内标甲醇溶液终止反应。置于冰板1h，然后在4℃下，20000 g/min离心10min，取上清部分储存在-40℃，直到进行HPLC分析。对照组是不含NADPH，底物或微粒体的体系，确保花椒毒酚代谢产物的形成是依赖人的肝微粒体和NADPH的。
　　二、利用重组CYP450酶系确定花椒毒酚的代谢酶
　　利用体外重组单酶CYP450酶(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4)，加入花椒毒酚，测定花椒毒酚代谢产物生成量的变化，确定花椒毒酚的代谢酶，确定代谢酶后，测定在代谢酶的酶促动力学。
　　三、花椒毒酚对CYP450酶抑制实验
　　抑制实验采用由肝微粒体、NADPH-再生系统组成的上述孵育系统，探针底物和花椒毒酚或CYP450酶特异性抑制剂，探针底物的浓度大约等于Km值。酶活性被抑制90％以上的进行动力学分析;花椒毒酚对CYP1A2和CYP3A4半数抑制浓度IC50值通过与（0-100μM）各种浓度的花椒毒酚孵育获得的;Ki值是通过与各种浓度的花椒毒酚和探针底物孵育获得的。
　　四、花椒毒酚的酶促动力学研究
　　为了估算花椒毒酚动力学参数，确保反应时间和微粒体的浓度均在线性区间内，根据预实结果，花椒毒酚(0.25-200μM)分别与混合人微粒体孵育30min。动力学参数Km和Vmax通过米氏方程对实验数据进行非线性拟合求得，并采用用Eadie-Hofstee作图（速度对速度与底物浓度之比的作图法）进行验证，明确代谢是单相还是双相。
　　五、分子对接实验
　　本实验中人CYP1A2（pdb编号:2HI4）和CYP3A4(pdb编号:4K9W)晶体结构从RCSB蛋白质数据库（http://rcsb.org.pdb/）中下载。用于对接的配体用分子模拟软件SYBYL X2.1进行处理，其能量最小化使用外部的Tripos分子力场，蛋白质和配体的能量质子态化和能量最小化计算采用分子模拟软件SYBYLX2.1的默认设置。利用Gold v5.2对接软件，在晶体结构中，活性位点被确定为以天然配体为中心，6.0(A)的球形范围。对接构象用打分函数CHEMPLP进行记分，配体的最佳对接构象直观的用Pymol Molecular Graphics System v1.3作图表示。
　　六、补骨脂定在不同种属中代谢产物的鉴定
　　补骨脂定(10μM)在Cyno猴、小型猪、比格犬、SD大鼠、人和兔肝微粒体中孵育30 min，通过HPLC/MS/MS鉴定其代谢产物。液相色谱仪采用WatersAcquity UPLCⅠ-Class体系，色谱柱为iKeyCSH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)，流动相为0.1％甲酸水（色谱级别）(A)，色谱级别乙腈(B)，梯度洗脱，0.0-10.0min（乙腈:30％～50％），10-11 min（乙腈:50％～90％），11-12 min(乙腈:90％)，12-13min（乙腈:90％～30％），以及13-15 min（乙腈:30％）。流速3μL/min，柱温55℃，进样体积0.5μL，以局部循环的方式。质谱为Waters SynaptG2-Si。
　　结果：
　　一、花椒毒酚代谢产物的分析
　　在花椒毒酚(10μM)与HLMs和NADPH再生系统孵育30min，生成的产物M，保留时间为3.7min，在没有NADPH、或没有底物、或没有微粒体的阴性对照组中没有观察到产物M。
　　二、确定花椒毒酚代谢的CYP450酶亚型
　　采用重组人P450单酶，包括CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19和CYP1A2。结果显示花椒毒酚的代谢产物(M)主要是由同工酶CYP1A2催化产生，如果将CYP1A2的催化量标准化成100％的话，其它同工酶的贡献率分别是CYP3A4(4.5％)、CYP2D6(0％)、CYP2E1(7.3％)、CYP2C9(13.5％)及CYP2C19(3.6％)。
　　三、花椒毒酚对CYP3A4和CYP1A2酶的抑制作用
　　所有CYP450酶阳性对照抑制剂明显抑制相应的CYP450特异性底物的代谢反应，剩余活性不超过20％。而花椒毒酚(100μM)对CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、CYP2C8、CYP2C19和CYP2E1酶活性的抑制作用，其酶剩余活性分别是3.3、35.9、9.5、82.1、72.4、52.1、68.3和25.9％。此外，测定了花椒毒酚对CYP1A2和CYP3A4酶抑制的动力学参数，花椒毒酚抑制非那西汀O-脱乙基(CYP1A2)和睾酮6β-羟基化(CYP3A4)，其抑制呈浓度依赖性。花椒毒酚对CYP1A2和CYP3A4的半数抑制浓度IC50值分别为（27.82±1.35）μM和（7.43±0.65）μM。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Dixon作图显示花椒毒酚对CYP1A2和CYP3A4的抑制是非竞争性抑制，其Ki值分别是（21.15±0.80）μM和（2.22±0.31）μM。
　　四、花椒毒酚的代谢动力学特征
　　在整个实验的浓度范围内，花椒毒酚的代谢符合典型的米氏动力学，反应速度呈现浓度依赖特征，并通过Eadie-Hofstee作图验证。利用Origin软件，通过非线性回归计算获得Vmax和Km值分别是（0.55±0.05）nmol·min-1·mg-1蛋白和（8.46±0.76）μM，固有清除(CLint)是（0.06±0.02）mL· min-1·mg-1蛋白。
　　利用花椒毒酚在人肝微粒体代谢的动力学参数，计算出肝脏清除率CLH是（15.91±0.32）mL·min-1·kg-1体重。CLH比肝血流量(QH)的百分比是76.8％。
　　五、分子对接研究
　　花椒毒酚与CYP1A2 ILE（异亮氨酸）117之间存在疏水作用，另外花椒毒酚的苯环与CYP1A2的PHE（苯丙氨酸）125，PHE（苯丙氨酸）226及PHE（苯丙氨酸）260之间有π-π堆积作用。花椒毒酚与CYP3A4对接的结果显示，花椒毒酚与CYP3A4通过氢键与ARG（精氨酸）105结合，以及通过疏水作用与ILE（异亮氨酸）369和LEU（亮氨酸）373结合。
　　六、补骨脂定代谢产物的确定
　　为了探寻补骨脂定在体内的代谢产物及其代谢途径的总体轮廓，本章采用UHPLC/Q-TOF MS技术，将MSE数据采集模式与MetabolynxTM软件的质量亏损过滤(DMF)技术结合，对补骨脂定在人，Cyno猴小型猪，兔，比格犬及SD大鼠肝微粒体中孵育结果进行分析和鉴定，以期为补骨脂定在体内代谢转化和发挥药效提供实验依据。在各个种属中共检测代谢产物共11个。
　　结论：
　　1、花椒毒酚在人肝微粒体中代谢是CYP450s催化的。
　　2、花椒毒酚代谢产物的形成主要由同工酶CYP1A2催化，而其它同工酶对花椒毒酚代谢的贡献是有限的。
　　3、花椒毒酚对CYP1A2和CYP3A4酶有很强的抑制作用，抑制形式是非竞争性抑制。因此，花椒毒酚与通过CYP3A4或CYP1A2代谢的药物共同使用的时候，可能产生以基于代谢的药物-药物相互作用。
　　4、花椒毒酚的代谢服从典型的米氏动力学，其代谢由一种CYP450同工酶或两种Km值相同的CYP450同工酶催化的。根据花椒毒酚的肝脏清除率推测，花椒毒酚在人体内是高清除药物。
　　5、分子对接的结果提示，花椒毒酚与CYP1A2和CYP3A4酶存在强烈的相互作用。
　　6、补骨脂定在六个种属肝微粒体的代谢产物结构和可能代谢途径已确定，存在明显的种属差异。通过比较代谢产物，兔和SD大鼠与人最为相近，因此在研究补骨脂定的代谢途径时，注意动物模型的选择。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 花椒毒酚在人肝微粒体代谢及对CYP450酶抑制的研究

前言

实验材料及方法

结果

讨论

结论

论文二 利用液质联用技术对补骨脂定在肝微粒体代谢产物的分析

前言

实验材料及方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 细胞色素P450酶的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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