低氧促有丝分裂因子在肺动脉高压所致右心衰中的作用及其机制

摘要

目的：
　　本研究通过建立低氧SU5416肺动脉高压模型，采取HIMF基因敲除及HIMF直接刺激原代培养心肌细胞等技术，观察HIMF是否直接参与PAH，是否对心脏有直接作用，是否直接损伤心肌的能量代谢及其机制做出研究，为肺动脉高压治疗提供理论依据。
　　方法：
　　一、动物模型制备及分组
　　1.小鼠肺动脉高压模型建立
　　本实验采用低氧(10％ O2)和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelialgrowth factor receptorⅡ，VEGFRⅡ)抑制剂SU5416皮下注射的方法建立PAH模型。SU5416注射每周一次，持续4周，且小鼠一直放入10％氧的实验箱中。4周后监测小鼠右心室收缩期压力，监测小鼠Fulton指数(右心室重量/左心室和室间隔重量，RV/(LV+S))，对肺组织行病理染色分析确定PAH模型成功。
　　2.实验动物分组
　　野生型小鼠和HIMF基因敲除小鼠一共32只（其中野生型小鼠16只，HIMF基因敲除小鼠16只），分为四组:1.野生型对照组(WT，野生型小鼠，n=8，溶剂每周一次皮下注射，空气吸入四周);2.HIMF基因敲除型对照组(HIMF KO，HIMF基因敲除小鼠，n=8，溶剂每周一次皮下注射，空气吸入四周);3.野生型实验组（WT SuHx，野生型小鼠，n=8，SU5416每周一次皮下注射并且10％ O2吸入四周）;4.HIMF基因敲除实验组（KO SuHx，HIMF基因敲除小鼠，n=8，SU5416每周一次皮下注射并且10％ O2吸入四周）。
　　二、动物标本采集和处理
　　小鼠在经过右心室压力测定后行心脏穿刺采血，之后迅速剪开胸腔，联合取出心肺。结扎左主支气管后，从气管内注射低熔解度的琼脂糖至右肺，并把肺脏置于冰上以使琼脂糖凝固，以备病理学检查。左肺一部分用于Western blot分析，一部分用于Real-time PCR分析。心脏取出后分离右心室和左心室并分别称重，计算Fulton指数。左右心脏分别用于病理学检查，Western blot和Real-time PCR分析。
　　三、新生大鼠心肌细胞原代培养
　　选取生后1至3天的Sprague Dawley大鼠，无菌条件下取左心室，采用磁力搅拌器，胰酶和胶原酶混合多次消化的方法分离心肌细胞，并进行原代培养，给予重组HIMF蛋白孵育后进行分子生物学指标检测。
　　四、实验方法及检测指标
　　1.活体小鼠右心室电极置入行右心室压力测定。
　　2.心脏右心室、左心室和室间隔重量测定以计算Fulton指数。
　　3.小鼠肺血管和组织染色。
　　4.Real-time PCR检测小鼠肺脏、心肌组织HIMF mRNA和心肌细胞能量代谢相关基因表达。
　　5.Western Blot检测肺脏、心肌组织HIMF和心肌细胞能量代谢相关蛋白表达。
　　6.Seahorse细胞能量实时测定系统行心肌细胞氧耗、细胞外酸度等能量测定。
　　7.电镜检查评定HIMF对心肌细胞线粒体超微结构的影响。
　　8.基因芯片分析HIMF对心脏基因表达的影响。
　　结果：
　　1.HIMF基因敲除减弱低氧和SU5416所致的肺动脉重构、右心室高压和肥厚
　　小鼠经过4周低氧(10％02)和SU5416皮下注射后行开胸右心室压力测定、肺组织病理学检查和Fulton指数测定。野生型小鼠在经过低氧和SU5416皮下注射后右心室收缩期压力相对于对照组明显升高(P＜0.01)，Fulton指数升高(P＜0.0l)，肺组织病理学检查发现肺小动脉管径变窄，肺小动脉内皮细胞和平滑肌细胞增生，肺小动脉肌化，肺动脉高压模型成功。
　　2.HIMF在肺动脉高压小鼠肺和右心室表达量增高
　　低氧和SU5416诱导野生型小鼠产生肺动脉高压，对野生型小鼠肺和心脏进行实时定量PCR分析显示:野生型小鼠在SU5416和10％0228天诱导下肺组织HIMF表达量相对于对照组升高了1.48倍(P＜0.01)，右心室HIMF表达量相对于对照组升高了87％(P＜0.01)，western blot分析证实了实时定量PCR的结果。
　　3.重组HIMF蛋白静脉注射造成肺动脉高压及右心室肥厚
　　野生型小鼠在经过30天重组HIMF蛋白注射后，肺小动脉管腔变窄，血管内皮平滑增生肌化，而对照组野生型小鼠并没有肺小动脉肌化。重组HIMF蛋白注射的小鼠右室收缩末期压力和Fulton指数相对于对照组明显升高。
　　4.重组HIMF蛋白静脉注射显著降低右心室脂肪酸代谢相关基因的表达
　　对小鼠心脏mRNA行基因芯片分析结果显示，重组HIMF蛋白注射组小鼠和对照组小鼠右心室基因表达水平有显著的变化。基因芯片数据通过gene ontology数据库分析显示，重组HIMF蛋白静脉注射显著降低了右心室脂肪酸beta氧化相关的基因ACADS(Acyl-CoA dehydrogenase，C-2 to C-3 short chain，负责短链脂肪酸代谢)，ACADM（acyl-Coenzyme A dehydrogenase，C-4 to C-12 straight chain，负责中链脂肪酸代谢）和ACADL(Acyl-CoA dehydrogenase，long chain，负责长链脂肪酸代谢)的表达，而且HIMF显著下调了编码线粒体内电子传递链复合物的基因表达。
　　5.HIMF下调离体心肌细胞脂肪酸氧化相关基因的的表达
　　对HIMF孵育24小时的离体心肌细胞进行分析，相对于对照组，HIMF显著下调了离体心肌细胞ACADS，ACADM和ACADL的基因表达，这和基因芯片结果相符合。PGC-1α，PPARα和ERRα等是FAO的关键转录调节基因，也是ACADS，ACADM和ACADL上游调节基因，HIMF孵育显著降低PGC-1α，PPARα和ERRα的表达。同时HIMF还降低CD36和CPT1α等脂肪转运蛋白的表达。
　　6.HIMF抑制离体心肌细胞糖氧化上调糖酵解
　　对HIMF孵育24小时的离体心肌细胞进行分析，相对于对照组，HIMF显著下调了离体心肌细胞糖氧化相关基因的表达:柠檬酸合成酶（citrate synthase，CS）下调44％，丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)下调37％，相反，HIMF上调糖酵解相关基因的表达:丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)上调1.34倍，葡萄糖转运酶1（glucose transporter1，GLUT1）上调1.08倍。
　　7.HIMF降低离体心肌细胞OCR，增加ECAR，损害细胞能量代谢
　　通过Extracellular Flux Analyzer对HIMF孵育24小时的离体心肌细胞进行分析，相对于对照组，HIMF下调了离体心肌细胞基础氧消耗率(oxygen consumption rate，OCR)，ATP相关联的OCR和最大OCR;显著提高细胞外酸度(Extracellularacidification rate，ECAR)和质子产生率(Proton production rate，PPR)。
　　8.HIMF损害心肌细胞线粒体超微结构，下调线粒体基因组
　　通过电镜观察HIMF孵育24小时的离体心肌细胞后发现，HIMF破坏了心肌细胞线粒体的超微结构，经过HIMF处理的线粒体密度降低，线粒体大小和形状不一，出现巨大线粒体，线粒嵴消失，体线粒体出现空泡及出现碎片状线粒体。Real-timePCR结果分析显示，HIMF下调了线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factorA，Tfam)，线粒体拓扑异构酶Ⅰ(mitochondrial topoisomeraseⅠ，Top1imt)，线粒体DNA聚合酶gamma2(mitochondrial DNA polymerase subunit gamma2，Polg2)和线粒体RNA多聚酶(DNA-directed RNA polymerase，mitochondrial，Polrmt)等基因的表达。这些线粒体DNA在线粒体功能调控上起重要作用。
　　9.HIMF通过激活NF-κB信号通路，增强p65与PGC-1α结合从而下调PGC-1α的表达
　　通过Western blot结果分析，HIMF激活离体心肌细胞NF-κB通路，并通过亚单位p65的激活下调心肌细胞PGC-1α及其他能量代谢相关基因的表达。对HIMF孵育后的心肌细胞核蛋白行免疫沉淀分析发现，HIMF显著增强了p65和PGC-1α的结合，通过p65和PGC-1α的结合降低PGC-1α的表达。
　　结论：
　　1.HIMF基因敲削弱小鼠在低氧和SU5416下所致的肺动脉高压，重组HIMF蛋白尾静脉注射造成小鼠肺动脉高压及下调右心室能量相关基因的表达。
　　2.HIMF对离体心肌细胞有直接作用，通过下调离体心肌细胞能量代谢相关相关基因的表达，破坏离体心肌细胞线粒体超微结构等损害心脏的能量代谢。
　　3.HIMF通过激活NF-κB信号通路，增强p65与PGC-1α结合从而下调PGC-1α的表达，下调心肌细胞能量代谢。

目录

声明

摘要

论文一 低氧促有丝分裂因子诱导小鼠肺动脉高压及右心能量代谢异常

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

论文二 低氧促有丝分裂因子直接损害心肌细胞的能量代谢

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 低氧促有丝分裂因子通过激活NF-κB亚单位p65影响心肌细胞脂肪酸氧化代谢

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

创新性及自我评价

参考文献

综述 肺动脉高压所致右心衰的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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