特丁基对苯二酚对酒精诱导的心肌细胞凋亡的影响及其机制研究

摘要

长年饮用过量酒精能够引起心脏进行性扩大、并发各种心律失常和心力衰竭，以此为特征的心肌病变被称为酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy，ACM)。在全世界范围内，酒精性心肌病的患病率都不断上升，严重威害了人类的健康，并导致卫生资源的巨大浪费。ACM的发病机制有多种，氧化应激与细胞凋亡是其中两个最重要的机制。酒精可以诱导氧化应激，氧化应激又可以诱导细胞凋亡，这些诱导的损伤变化可以引起心肌细胞功能某些方面的改变，因此可以导致心肌细胞功能障碍，最终降低心肌功能，造成酒精性心肌病。因此，研究一种能够防治酒精诱导的氧化应激损伤和心肌细胞凋亡的低毒且有效的药物，对改善ACM预后有着非常深远的意义。
　　特丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ)又名为特丁基氢醌，是一种安全有效的抗氧化剂，较其它抗氧化剂具有更为确切的抗氧化稳定性。在神经细胞及其他细胞系的研究中发现它具有抵抗氧化应激损伤、对抗细胞凋亡的作用，对心血管系统的作用研究还尚未有报道过。此外有研究表明特丁基对苯二酚可以保护颅神经嵴细胞对抗酒精诱导的凋亡，在外周组织细胞如肝、肾等，tBHQ也具有保护作用。因此，我们很有理由去研究特丁基对苯二酚是否也能对心血管疾病中的氧化应激损伤和心肌细胞凋亡产生作用。
　　核NF-E2有关因子2(nuclear factorE2-related fator2，Nrf2)是细胞氧化应激中的中枢调控者。在转录正常情况下，Nrf2与Keapl（kelch-l ike ECH-associated proteinl）相互结合，Nrf2的活性作用被Keapl所抑制，并锚定在细胞浆中，在激活情况下，Keapl和/或Nrf2的结构发生变化，导致Nrf2和Keapl的绑定解除，Nrf2脱离了Keapl的束缚，之后转入了细胞核，在Maf的参与下与抗氧化反应元件(antioxidantresponse element，ARE)序列结合，诱导与抵抗氧化应激有关的酶基因表达。这些抗氧化酶能够抵抗活性氧(reactive oxygen species，ROS)及毒性物质等对细胞进行的侵害。研究还发现Keapl与凋亡相关蛋白FAC1、PGAM5、SQSTM1和p26均有关，Keapl还可与Bcl-2结合，使Bax表达增多，激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)而诱导细胞凋亡。Nrf2可以控制Keapl的转录而拮抗Keapl的作用，提示Nrf2信号通路与细胞凋亡通路之间可能存在某种非常重要的联系。由上可见，Nrf2细胞信号通路在保护细胞免受氧化应激损伤，抑制细胞凋亡和促进细胞存活方面有着非常重要的意义。
　　目的:
　　为此本实验拟采用H9c2心肌细胞，建立酒精诱导心肌细胞凋亡模型。观察了在离体细胞给予tBHQ治疗后是否可以减轻酒精诱导的心肌细胞凋亡，并且分析了tBHQ抗心肌细胞凋亡的可能机制，这种保护作用是否是部分通过激活抗氧化反应通路Nrf2，调节Bcl-2和Bax的表达而实现的。
　　方法:
　　1.以H9c2心肌细胞作为研究对象，设立正常对照组;酒精组;tBHQ组;tBHQ+酒精组。浓度根据已有文献和预实验确定。
　　2.采用四唑盐法检测tBHQ对心肌细胞存活率的影响。
　　3.应用凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪检测细胞的凋亡。
　　4.采用活性氧检测试剂盒通过流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞内活性氧(ROS)的水平。
　　5.应用免疫荧光技术观察Nrf2的核转位。
　　6.采用western blotting法检测心肌细胞总-Nrf2、核-Nrf2、SOD、catalase、HO-1、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表达。
　　7.Nrf2 siRNA双链寡核苷酸干扰细胞及相关指标检测。
　　8.利用(x)±s的表示方法呈现各组实验数据，并将实验结果数据导入专用数据分析软件spss13.0进行科学分析，采用Student' s t-test和单因素方差分析进行统计学比较，p＜0.05作为有统计学意义的标准。
　　结果:
　　1.显微镜下观察细胞形态接种的心肌细胞24h后，绝大多数已经贴壁良好，多呈梭形，细胞相互连接成网;酒精组细胞变形明显，漂浮细胞较多;tBHQ组细胞贴壁良好，形态同对照组无明显异常改变;tBHQ预处理明显改善了酒精引起的细胞形态改变。
　　2.细胞存活率酒精以浓度依赖的方式导致细胞的存活率下降，200mmol/L时细胞存活率下降更为明显。不同浓度tBHQ(0，0.625，1.25，2.5，5，10，20，50 and100μmol/L)处理细胞48h对细胞生存力无明显影响。tBHQ预处理细胞明显升高酒精所导致的细胞存活率下降，并呈浓度依赖的方式，从1μmol/L开始有统计学意义，10μmol/L与5μmol/L时比较生存率未明显增强，故后续实验以5μmol/L来研究tBHQ的保护作用。
　　3.细胞凋亡率AnnexinⅤ-FITC/PI检测心肌细胞凋亡率显示200mmol/L的酒精可导致心肌细胞凋亡率明显增加，而tBHQ预处理细胞与酒精组相比明显降低了细胞凋亡率。
　　4.ROS含量细胞内ROS的含量可以cDCF的荧光强度表示，结果显示200mmol/L的酒精可导致细胞内荧光强度明显增强，而tBHQ预处理细胞与酒精组相比细胞内荧光强度明显下降。
　　5.免疫荧光分析酒精组明显抑制了Nrf2的表达及核转位，而tBHQ预处理组与酒精组相比，明显促进了Nrf2的表达及核转位。
　　6.Western blotting分析结果显示酒精组Bcl-2蛋白表达量较对照组明显减少，而Bax表达较对照组明显增加，caspase-3蛋白表达较对照组也明显增加，差异具有显著性(p＜0.05)。而tBHQ预处理组提高了Bcl-2的表达，却降低了Bax还有caspase-3蛋白的表达，与酒精组比较差异均有显著性。与此相对应，酒精组总-Nrf2、核-Nrf2、SOD、catalase和HO-1蛋白表达量较对照组明显减少(p＜0.05)。tBHQ预处理组可以明显增加心肌细胞总-Nff2、核-Nrf2、SOD、catalase和HO-1蛋白表达(P＜0.05)。
　　7.转染Nrf2 siRNA结果显示对照组及tBHQ药物组转染Nrf2 siRNA后，Nrf2及其下游的HO-1蛋白表达量均明显降低。tBHQ预处理组可以明显抑制酒精导致的caspase-3凋亡蛋白的表达，同时也可降低酒精导致的心肌细胞内ROS含量的增加。而给予Nrf2 siRNA特异敲弱Nrf2的表达后，tBHQ预处理组的这种抑制凋亡蛋白表达和降低ROS含量的作用减低。
　　结论:
　　1.酒精对H9c2心肌细胞以浓度依赖的方式导致细胞存活率降低，200mmol/L酒精可明显造成心肌细胞损伤，明显降低细胞存活率。
　　2.200mmol/L酒精可明显增加心肌细胞ROS的产生，明显增加心肌细胞凋亡发生。
　　3.200mmol/L酒精明显抑制了心肌细胞Nrf2表达、Nrf2核转位和下游SOD、catalase、HO-1的表达，这可能与增加心肌细胞对酒精的敏感性有关。
　　4.tBHQ可能通过清除细胞内过多的ROS来参与酒精诱导细胞损伤的保护。
　　5.Nrf2及下游SOD、catalase、HO-1抗氧化通路可能为tBHQ对抗酒精诱导心肌细胞凋亡的重要信号转导机制。
　　6.tBHQ还可能通过直接调节凋亡相关Bax、Bcl-2及caspase-3蛋白的表达而抑制细胞凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分论文 特丁基对苯二酚对酒精诱导的心肌细胞凋亡的的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

第二部分论文 特丁基对苯二酚对酒精诱导的心肌细胞损伤的保护机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 酒精性心肌病发病机制研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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