人巨细胞病毒miRNA-US4-1及miRNA-US4-5p靶基因的筛选和功能研究

摘要

目的:
　　人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人群中呈普遍感染状态，一般为隐性感染，多数感染者为健康的病毒携带者。但在先天感染及免疫能力低下的人群中，HCMV的致病率和死亡率显著提高，其详细致病机理尚不清楚。HCMV是目前唯一被证实具有编码miRNA能力的β疱疹病毒，研究表明，miRNA对细胞凋亡、增殖、分化、致癌等生物过程有调节作用。近年来，HCMV编码miRNA对基因转录后调控的研究也成为HCMV致病机理研究的热点。
　　迄今为止已经发现HCMV从16种前体中至少编码26种成熟的miRNAs，自从2004年第一次报道病毒表达miRNAs后;大量的研究表明，病毒的miRNAs发挥着丰富的作用，这其中包括:增殖，分化，细胞周期，凋亡和免疫应答。
　　凋亡是程序性的细胞死亡，通常具有明显的形态特征，包括细胞皱缩，卷曲，固缩以及能量依赖的生化机制。HCMV编码的miRNAs被报道有调控细胞凋亡的能力。例如miR-UL148D可以通过下调IEX-1的表达发挥抗凋亡的作用，miR-US25-1可以通过靶向BRCA1/BRCA2复合体亚族3，增加氧化低密度脂蛋白介导的凋亡。然而miR-US4-1和miR-US4-5p在细胞凋亡中的作用还没有被报道过。
　　为明确miR-US4-1和miR-US4-5p的生物学功能，本研究拟采用hybrid PCR、荧光素酶活性检测实验及免疫印迹实验(Western blot)等方法来鉴定与miR-US4-1和miR-US4-5p相互作用的靶基因。并针对不同靶基因的生物学功能设计不同的功能研究实验路线，明确miR-US4-1和miR-US4-5p的生物学功能。
　　方法:
　　一、实验材料
　　1、HCMV临床分离株Han、HCMV han株细菌人工染色体(HCMV han BAC)
　　2、人胚肾细胞HEK293、人胚肺成纤维细胞HELF、人外周血的单核细胞系THP-1。
　　3、核酸提取相关试剂
　　4、荧光定量PCR检测相关试剂
　　5、构建表达载体相关试剂
　　6、双萤光素酶试验检测相关试剂
　　7、Western blot印迹杂交的相关试剂
　　8、Power SYBR Green PCR检测试剂
　　9、凋亡检测试剂
　　10、常用实验设备包括紫外分光光度计、流式细胞仪、荧光分光光度计、酶标仪、全温振荡培养箱、自动凝胶成像分析仪等。
　　11、常用分析软件及数据库包括凝胶成像及扫描分析软件、基因组数据库、SPSS version13.0、引物设计软件(Primer5)等。
　　二、实验方法
　　人巨细胞病毒miR-US4-1靶基因的鉴定及功能研究
　　1、采用实时荧光定量PCR方法检测HCMV感染人胚肺成纤维细胞中miR-US4-1的表达。
　　2、采用hybrid PCR方法筛选HCMV感染人胚肺成纤维细胞中miR-US4-1靶基因。
　　3、将hybrid PCR方法获得的靶基因以及生物信息学软件预测的靶基因的3'-UTR全长序列构建到pMIR-REPORTERTM Luciferase载体中，通过荧光素酶活性检测荧光值的变化判断miR-US4-1与候选靶基因3'-UTR的结合能力，并确定与细胞凋亡相关的谷氨酰胺tRNA合成酶(QARS)。
　　4、构建QARS3'-UTR突变型荧光素酶报告基因表达载体，应用荧光素酶活性检测，进一步验证miR-US4-1与QARS3'-UTR的直接结合作用。
　　5、通过Western blot方法检测miR-US4-1对HCMV感染刺激下HELF细胞产生的内源性QARS蛋白表达水平的影响。
　　6、利用流式细胞术检测体外过表达miR-US4-1靶向调控QARS表达对HCMV感染状态下的细胞凋亡的影响。
　　7、绘制过表达miR-US4-1的HCMV病毒生长曲线，明确miR-US4-1与感染性病毒颗粒释放的关系。
　　人巨细胞病毒miR-US4-Sp靶基因的鉴定及功能研究
　　1、采用实时荧光定量PCR方法检测HCMV感染人胚肺成纤维细胞中miR-US4-5p的表达。
　　2、采用hybrid PCR和软件筛选方法筛选HCMV感染人胚肺成纤维细胞中miR-US4-5p靶基因。
　　3、将两种筛选方法的共同候选靶基因P21活化蛋白激酶2(PAK2)的3'-UTR全长序列构建到pMIR-REPORTERTM Luciferase载体中，通过荧光素酶活性检测荧光值的变化判断miR-US4-5p与候选靶基因P21活化蛋白激酶2(PAK2)3'-UTR的结合能力。
　　4、构建PAK23'-UTR突变型荧光素酶报告基因表达载体，应用荧光素酶活性检测，进一步验证miR-US4-5p对PAK23'-UTR的直接结合作用。
　　5、通过Western blot方法检测miR-US4-5p对HEK-293、HELF及THP-1等三种不同细胞系内源性表达的PAK2蛋白质水平的影响;以及在HCMV感染的HELF细胞中，不同时相PAK2蛋白表达水平的差异。
　　6、利用流式细胞术检测过表达miR-US4-5p对细胞凋亡的影响。
　　结果:
　　一、人巨细胞病毒miR-US4-1靶基因的鉴定及功能研究
　　1、通过Taqman实时荧光定量PCR检测，观察到miR-US4-1的表达量在感染HCMV时高表达
　　2、经过hybrid PCR筛选，共得到8个候选靶基因。其中与细胞凋亡相关的靶基因QARS3'-UTR与miR-US4-1结合能力较强，而miR-US4-1针对QARS3'-UTR突变型的负调控能力消失。
　　3、对靶基因QARS进行了蛋白表达水平的检测，结果表明QARS蛋白的表达水平被miR-US4-1下调，证实QARS是miR-US4-1的直接靶基因。
　　4、检测HCMV感染不同时相，HELF中QARS蛋白和miR-US4-1的表达，发现二者负相关。
　　5、检测过表达miR-US4-1对于感染HCMV的人胚肺成纤维细胞HELF凋亡的影响。发现miR-US4-1可以增加HCMV感染所导致的凋亡。
　　6、进一步绘制了HCMV生长曲线，结果表明过表达miR-US4-1可以促进感染性病毒颗粒的释放。
　　二、人巨细胞病毒miR-US4-5p靶基因的鉴定及功能研究
　　1、荧光素酶活性检测结果显示候选靶基因P21活化蛋白激酶2(PAK2)明显受到miR-US4-5p的负调控。而种子区突变后，miR-US4-5p针对PAK23'-UTR突变型的负调控能力消失。
　　2、对靶基因PAK2进行了蛋白表达水平的检测，结果显示HEK-293、HELF及THP-1三种不同细胞系表达的PAK2水平均被miR-US4-5p明显下调，证实PAK2是miR-US4-5p的直接靶基因。
　　3、HCMV感染下调PAK2蛋白水平，其中感染72 h下调最明显。
　　4、流式细胞术检测发现过表达miR-US4-5p靶向下调PAK2表达促进饥饿诱导的三种不同细胞的凋亡。
　　结论:
　　1、人巨细胞病毒miR-US4-1靶向作用谷氨酰胺tRNA合成酶QARS3'-UTR特定区域，负性调控该基因的表达，进一步影响细胞凋亡和感染性病毒颗粒的释放。
　　2、人巨细胞病毒miR-US4-5p通过靶向作用P21活化蛋白激酶2(PAK2)特定区域，负性调控该基因的表达，促进饥饿诱导的三种不同细胞的凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 人巨细胞病毒miR-US4-1靶向下调QARS表达抑制病毒DNA合成及病毒复制的研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

研究创新性的自我评价

参考文献

论文二 人巨细胞病毒miR-US4-5p靶向作用PAK2表达促进饥饿诱导的三种不同细胞的凋亡

前言

材料与方法

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 人巨细胞病毒miRNA生物学功能的研究进展

在学期间的科研成绩

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