孕哺期不同程度碘缺乏对仔鼠小脑Pinceau结构发育的影响

摘要

目的：
　　碘对甲状腺激素(thyroid hormone，TH)的合成起到了至关重要的作用。TH又影响着中枢神经系统的正常发育。由于碘缺乏而引起的甲状腺激素合成障碍会导致神经系统发育紊乱，进而出现神经运动功能障碍。在妊娠过程中，母体是T4和碘供应的唯一来源。故母体的TH供应是影响着子代正常生长发育的关键因素所在。母体碘供应不足致使TH缺乏可直接导致子代脑发育期TH供应不足，损伤脑发育，造成子代不可逆的中枢神经系统损伤，出现听力、言语、行为、认知及运动方面的障碍。自我国实施了全民食盐加碘计划后，重度碘缺乏得到了控制，但仍会出现轻度碘缺乏和边缘性碘缺乏的情况。轻度碘缺乏会引起低甲状腺素血症，表现为血浆中游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)减少，而游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)和促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)含量没有改变。边缘性碘缺乏是更为轻微的一种碘缺乏，平均尿碘中位数(medianurinary iodine，MUI)在100～150μg/L，表现为血浆中FT3和FT4含量没有改变，但TSH可能出现轻微改变，T4总量下降。小脑的主要功能是运动协调，浦肯野细胞是小脑的主要细胞和唯一的传出神经元，浦肯野细胞功能的适当发挥依赖于pinceau结构的发育成熟。本研究通过建立妊娠期和哺乳期轻度和边缘性碘缺乏模型，研究不同程度碘缺乏是否影响pinceau结构的发育成熟，并阐明是否通过干扰小脑pinceau结构相关蛋白Ankyrin G(AnKG)、Neurofascin186(NF186)、NrCAM、β4-spectrin的作用机制。
　　方法：
　　一、实验动物与分组
　　健康雌性Wistar大鼠(130-150 g)，按体重随机分成4组:对照组、边缘性碘缺乏组、轻度碘缺乏组和重度碘缺乏组。各组给予碘缺乏地区饲料，饮用水加入不同剂量的KI去离子水。保证四组雌鼠每日总摄碘量依次为:7.0μg/d、5.0μg/d、3.0μg/d和1.5μg/d。雌性大鼠适应性饲养3个月后，交配妊娠。以次晨发现阴栓或阴道分泌物镜检发现精子者确定为妊娠0天(gestational day，GD0)。从GD0开始到仔鼠出生后21天(postnatal day，PN21)，各组取孕鼠20-21只。每组饮食同前。
　　二、仔鼠血清FT4、FT3、TSH测定
　　仔鼠PN7、PN14、PN21，进行心脏采血。血清离心，5000rpm离心10min。使用固相化学免疫发光法测血清中FT3、FT4、TSH的含量。
　　三、碘缺乏饲料
　　碘缺乏饲料来自碘缺乏流行病区。根据AIN-93G的啮齿动物的饮食指南，在每公斤碘缺乏饲料中加入35 g矿物质混合物(不含KI)、13 g赖氨酸、10 g维生素混合物、6.7g苏氨酸、1 g胆碱、2.1g色氨酸、4.6g蛋氨酸。此外，为保证动物摄入足够的必需脂肪酸，每公斤饲料中加入10ml玉米油。食用这种补足了各种营养物质的碘缺乏饲料后再加入KI（7.0μg/d），则基本上能保证母鼠和仔鼠的正常生长和发育。
　　四、小脑浦肯野细胞Pinceau结构发育的形态学研究
　　分别于PN14和PN21时每组取6只仔鼠，4％多聚甲醛灌流固定小脑，用石蜡包埋后进行小脑切片。在PN14和PN21时，小脑浦肯野细胞层Calbindin和GAD65，Calbindin和NF186免疫荧光组织化学染色，观察仔鼠小脑浦肯野细胞Pinceau结构形态学改变。用图像分析系统及图像分析软件分析小脑各蛋白表达的荧光平均强度。
　　五、小脑浦肯野细胞Pinceau结构发育的相关蛋白western blot测定分析
　　分别于PN7、PN14和PN21时，每组选取6只仔鼠，断头后，进行小脑剥离。采用westem blot方法分别测定小脑AnKG、NF186、NrCAM和β4-spectrin的蛋白水平。采用全自动凝胶成像分析系统照相，检测4种蛋白条带的净光密度值。
　　六、统计分析
　　结果表示为mean±SD。用统计软件SPSS16.0对所有数据进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)比较仔鼠激素水平、免疫荧光染色的平均光密度和相关蛋白western blot结果。当差异有统计学意义时，采用SNK法进行组间的比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　一、仔鼠激素水平变化
　　仔鼠PN7、PN14、PN21时，轻度碘缺乏组的血清FT4水平显著低于对照组(P＜0.05);轻度碘缺乏组血清FT3和TSH较对照组无显著变化(P＞0.05)，而重度碘缺乏组TH显著低于对照组(P＜0.05)，而且TSH显著高于对照组P＜0.05）;边缘性碘缺乏组TH水平较对照组稍微下降，但是与对照组比较差异无统计学意义，而且TSH水平无变化。但是较对照组相比，总T4在PN7、PN14和PN21各下降16.41％、18.16％和22.54％。
　　二、不同程度的碘缺乏减少小脑浦肯野细胞Pinceau抑制性突触形成
　　在PN14和PN21时，镜下可见，在对照组中，由GAD65和Calbindin标记的pinceau突触在小脑浦肯野细胞层呈阳性表达，紧密分布。与对照组相比，边缘性碘缺乏组、轻度碘缺乏组和重度碘缺乏组GAD65阳性表达显著降低(P＜0.05），差异有统计学意义;轻度碘缺乏组和重度碘缺乏组GAD65阳性表达显著低于边缘性碘缺乏组（P＜0.05），差异有统计学意义。
　　三、不同程度碘缺乏抑制小脑浦肯野细胞Pinceau结构形成及发育成熟
　　在PN14和PN21，镜下可见，在对照组中，由NF186和Calbindin标记的pinceau结构在小脑浦肯野细胞胞体和AIS表达，呈阳性分布。与对照组相比，边缘性碘缺乏组NF186阳性表达显著降低（P＜0.05），差异有统计学意义;而轻度碘缺乏组和重度碘缺乏组NF186阳性表达显著低于对照组和边缘碘缺乏组(P＜0.05），差异有统计学意义。
　　四、不同程度碘缺乏降低仔鼠小脑浦肯野细胞Pinceau结构发育相关蛋白的表达水平
　　在PN7，各组仔鼠小脑AnKG蛋白表达均无明显差异;在PN14和PN21，轻度碘缺乏组和重度碘缺乏组仔鼠小脑AnKG蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05)，差异有统计学意义;在PN14时，边缘性碘缺乏组仔鼠小脑AnKG蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05），差异有统计学意义。在PN7、PN14和PN21，轻度碘缺乏组和重度碘缺乏组仔鼠小脑β4-spectrin蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05)，差异有统计学意义;在PN14时，边缘性碘缺乏组仔鼠小脑β4-spectrin蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05），差异有统计学意义。在PN21，重度碘缺乏组β4-spectrin蛋白表达较边缘性碘缺乏组相比显著降低(P＜0.05），差异有统计学意义。在PN7、PN14和PN21，与对照组相比，边缘性碘缺乏组、轻度碘缺乏组和重度碘缺乏组仔鼠小脑NF186和NrCAM蛋白表达显著降低(P＜0.05），均具有统计学意义。
　　结论：
　　1、孕期和哺乳期轻度及重度碘缺乏抑制仔鼠小脑Pinceau突触发育和结构成熟，边缘性碘缺乏对仔鼠小脑Pinceau突触发育和结构成熟抑制较轻。
　　2、孕期和哺乳期不同程度的碘缺乏损伤Pinceau发育，其机制可能是下调仔鼠小脑AnkG、NF186、NrCAM、β4-spectrin蛋白表达。

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结论

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综述 神经系统中轴突初始段的建立和维持

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