miRNA-21和IL-12A的靶标关系验证与生物信息学分析

摘要

背景:单纯疱疹性角膜炎(HSK)是一种缺乏有效治疗方法的致盲性眼病，多种免疫炎症相关细胞因子都能影响其发生、发展及转归。本课题组前期研究发现在小鼠HSK模型中IL-12A、IL-1β等细胞因子增多，同时有研究表明IL-12A、IL-1β、IL-6、CXCL-10、CCL-20、VEGF-A、MMP-2、MMP-9等细胞因子都可以加重HSK的严重程度。microRNA(miRNA)作为重要的转录后调控因子，一种miRNA可以调控其下游的多种靶基因的蛋白翻译，使其靶基因表达下调。
　　目的:寻找一种可同时调控以上IL-12A等多个HSK相关细胞因子的miRNA，验证其与细胞因子IL-12A的靶标关系，分析microRNA-21(miR-21)的生物信息学功能及其在HSK中可能的作用机制。
　　研究方法:运用TargetScan v7.1、miRanda v2010、miRBase v2014及miRTarBasev6.0数据库进行以上多个细胞因子的miRNA预测，寻找共同的miRNA;运用miRBase数据库对各物种miR-21序列进行对比;通过RGator v3.0数据库分析人(hsa)miR-21在各组织中的表达情况;通过数据库检索，找出尚未验证的且与HSK相关的hsa-miR-21候选靶基因进行靶标验证，通过构建IL-12A的3'-非翻译区(UTR)野生型及突变型载体质粒，将相应的质粒与hsa-miR-21模拟物转染到293T细胞中;通过双荧光素酶报告系统检测萤光素酶活性，初步验证两者的靶标关系;运用以上数据库进行hsa-miR-21的候选靶基因筛选，得出候选靶基因集合;对候选靶基因集合进行基因功能富集分析、信号转导通路富集分析和蛋白互作网络分析;通过以上结果分析hsa-miR-21在HSK中可能的作用机制。
　　结果:通过以上数据库检索分析发现hsa-miR-21是可以同时调控以上多个HSK相关细胞因子的miRNA;各物种miR-21的序列基本一致。hsa-miR-21在人体各组织中均见表达，程度不一。研究发现IL-12A是尚未验证的且与HSK相关的候选靶基因。双荧光素酶报告系统分析表明hsa-miR-21能够靶向作用于IL-12A的3'-UTR(t=-24.43，P＜0.05)，初步证明两者具有靶标关系。筛选hsa-miR-21的候选靶基因共609个，其基因功能主要富集于调节细胞过程、细胞大分子代谢过程、负调控细胞过程、蛋白质修饰过程、细胞蛋白质代谢过程、细胞内、细胞质、细胞核、细胞器、蛋白质结合、酶结合、激酶结合、蛋白激酶活性、序列特异性DNA结合(P＜0.05)，并涉及到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路、单纯疱疹感染通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、NF-κB信号通路、转化生长因子(TGF)-β信号通路、Toll样受体信号转导通路、细胞周期及凋亡信号通路及多种癌症通路(P＜0.05)。通过以上结果分析hsa-miR-21可能通过MAPK信号转导通路中的27个靶基因、单纯疱疹感染通路中19个靶基因、TNF信号通路中15个靶基因、NF-κB信号通路中的10个靶基因来调控HSK的发生和发展。
　　结论:hsa-miR-21可以结合于IL-12A的3'-UTR区，hsa-miR-21和IL-12A具有靶标关系;hsa-miR-21的靶基因参与多个生物学过程，与癌症和免疫炎症密切相关，其中MAPK信号转导通路、单纯疱疹感染通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路可能是其参与HSK免疫调节中主要的作用机制。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 实验材料

2．1．1 材料和试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 HSK相关细胞因子共同miRNA预测

2．2．5 Oligo合成载体与构建

2．2．6 细胞转染

2．2．7 双荧光素酶检测

2．2．8 miR-21靶基因预测

2．3 统计学分析

3．1 共同miRNA预测结果

3．2 miR-21的同源性及在各组织器官的表达情况

3．3 待验证候选靶基因的确定

3．4 细胞培养

3．5 细胞转染

3．6 双荧光素酶系统检测结果

3．7 miR-21的靶基因预测

3．8 miR-21靶基因的GO分析

3．9 miR-21靶基因的KEGG Pathway分析

3．10 miR-21靶基因的蛋白互作网络分析

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 单纯疱疹性角膜炎发病机制的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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