活体示踪GFP、SPIO标记的骨髓间充质干细胞治疗骨缺损的研究

摘要

目的:骨缺损的治疗一直是研究的热点，以往使用自体骨、异体骨、人工骨替代品等，然而大的骨缺损其利用率有限并受许多条件限制。随着组织工程学的发展，组织工程骨备受青睐，而种子细胞是组织工程骨的首要条件，以骨髓来源的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)尤为突出，因其低的免疫原性和不受伦理学的限制，且具有能在需要成骨的地方分化为成骨细胞的能力，所以成为近来研究的焦点。然而需要采用一种非侵袭性方法对标记的干细胞进行活体示踪，更好的了解干细胞在体内的生存、迁徙、分化等。常用的活体示踪方法有可见光成像、核磁共振、放射性核素成像等。
　　本研究使用绿色荧光蛋白(Green fluoreseent protein，GFP)、超顺磁性氧化铁（Superparamagnetic iron oxide，SPIO）双重标记骨髓间充质干细胞，并在体外培养，接种于羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)支架，移植到SD大鼠颅骨缺损模型中，并用小动物可见光成像对移植的干细胞进行荧光成像，最后用免疫组化的方法进一步证实干细胞的转归，同时也弥补了单一SPIO标记易出现假阳性的可能，为骨缺损的治疗提供了依据。
　　研究方法:本实验对GFP、SPIO标记的骨髓间充质干细胞进行体外培养，接种于HA支架，并在特定时间点2d、4w、8w、12w对细胞-支架共培养的复合物进行荧光检测。SD大鼠分成两组，细胞接种HA支架组10只、细胞未接种组10只，将细胞接种的HA支架体外培养1w后移植到SD大鼠颅骨缺损模型中，随后用小动物可见光成像对其进行荧光检测。在4w、8w、12w用小动物可见光成像分别对两组大鼠进行X线拍照，在X线片上进行骨密度测量，做出统计。12w后取材，使用免疫组化、普鲁士蓝、苏木精-伊红(Hemotoxylin-Eosin，HE)方法对组织切片进行观察。
　　结果:体外条件下，干细胞与HA支架结合良好，到达12w时间点，荧光显微镜观察显示，支架上仍然有大量的干细胞存在，且干细胞显示出很强的绿色荧光。体内条件下，小动物可见光成像显示，在移植后的第二天，可以观察到微弱的绿色荧光，之后的时间点荧光信号消失。骨密度测量显示，差异有统计学意义，接种细胞组好于未接种细胞组。免疫组化观察显示，移植的干细胞最终分化为成骨细胞，普鲁士蓝染色法观察到组织上有被染成蓝色的SPIO颗粒，HE染色显示出接种细胞组有大量的新骨生成。
　　结论:免疫组化的结果显示移植的干细胞最终分化为成骨细胞，且细胞接种支架组有大量的新骨生成，证实了组织工程骨在治疗骨缺损上是一个很好的方法。然而小动物可见光成像系统仅在干细胞移植后的第2d观察到了细胞的绿色荧光，而且很微弱，说明用GFP标记的干细胞用于活体示踪大鼠骨缺损治疗的方法不可靠。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 实验材料与方法

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 细胞的培养与检测

2．2．2 SPIO标记细胞与普鲁士蓝染色

2．2．4 造SD大鼠颅骨缺损模型及细胞-支架材料体内植入

2．2．5 小动物荧光及X线成像

2．2．6 颅骨取材制成切片

2．2．7 免疫组化染色观察

2．2．8 组织切片普鲁士蓝染色和HE染色

2．2．9 统计学分析

3 实验结果

3．1 GFP-BMSCs细胞图像及体外荧光强度检测

3．2 体外SPIO标记的GFP-BMSCs细胞普鲁士蓝染色

3．3 GFP、SPIO标记的细胞与HA支架体外结合

3．4 SD大鼠颅骨缺损模型及细胞-支架材料体内植入

3．5 小动物荧光成像及X线成像

3．6 动物及标本的大体情况

3．7 免疫组织化学分析

3．8 组织普鲁士蓝染色及病理学HE观察

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 骨髓间充质干细胞标记方法及活体示踪的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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