Caspase-11在鲍氏不动杆菌肺部感染中的作用

摘要

目的:
　　鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii，A.baumannii)作为条件致病菌，能引起皮肤、呼吸道及泌尿系统等多个部位感染。半胱天冬酶11 (caspase-11)能激活半胱天冬酶1 (caspase-1)及诱导细胞焦亡，在机体针对革兰阴性菌的先天免疫反应中发挥重要作用。本实验通过构建A.baumannii肺部感染模型，利用caspase-11基因敲除（caspase-11-/-）小鼠进行研究，探讨caspase-11在A.baumannii肺部感染中的作用。
　　方法:
　　研究对象为野生型C57BL/6（caspase-11+/+）小鼠和caspase-11-/-小鼠（背景为C57BL/6）及其骨髓来源的巨噬细胞(bone morrow-derived macrophage，BMDM)。在体感染采用A.baumannii(ATCC(@)BAA-1605TM);体外研究采用A.baumannii细菌裂解液。采用Westemblot检测BMDM和肺组织caspase-1和NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3)表达;采用ELISA检测细胞培养上清中白介素1α（IL-1α）和白介素1β (IL-1β)含量及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-1α、IL-1β、白介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量;采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)细胞毒性检测试剂盒进行细胞毒性分析;采用BALF涂片计数BALF中性粒细胞数;采用髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)检测试剂盒分析肺组织MPO活性;采用活菌平板计数法检测BALF及肺组织活菌数量;采用HE染色分析肺组织病理改变;采用A.baumannii LPS(50 mg/kg)腹腔注射构建A.baumannii败血症模型。干预因素包括IL-1α中和性抗体（50 μg/只、100 μg/只）感染前8小时腹腔注射、IL-1β中和性抗体（50 μg/只、100 μg/只）感染前8小时腹腔注射及NLRP3抑制剂MCC950(50 mg/kg)感染后24小时腹腔注射。采用Student's t检验或单因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)进行两组间或多组间比较;采用Kaplan-Meier法分析生存率;P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、A.baumannii能激活小鼠BMDM caspase-11介导的非典型炎性体信号通路及NLRP3介导的典型炎性体信号通路。①A.baumannii诱导caspase-11+/+BMDM表达caspase-1和NLRP3; caspase-11缺失部分抑制A.baumannii对caspase-1的诱导，但未影响A.baumannii对NLRP3的诱导作用。②A.baumannii诱导NLRP3caspase-11+/+BMDM分泌IL-1β，caspase-11缺失部分抑制A.baumannii对IL-1β的诱导作用。③A.baumannii诱导caspase-11+/+BMDM分泌IL-1α，caspase-11缺失完全抑制A.baumannii对IL-1α的诱导作用。④A.baumannii感染后，caspase-11-/-BMDM死亡率明显低于caspase-11+/+ BMDM。
　　2、Caspase-11缺失损害A.baumannii肺部感染初期中性粒细胞募集和细菌清除。①A.baumannii感染后6及24小时，caspase-11-/-小鼠BALF中性粒细胞数及肺组织MPO均显著低于caspase-11+/+小鼠，感染后72小时上述两个指标均高于caspase-11+/+小鼠。②A.baumannii感染后6、24及72小时，caspase-11-/-小鼠BALF及肺组织菌落数均显著高于caspase-11+/+小鼠。
　　3、Caspase-11缺失抑制A.baumannii肺部感染小鼠IL-1α分泌。①A.baumannii感染后6、24及72小时，caspase-11-/-小鼠BALF中IL-1α含量低于caspase-11+/+小鼠。②A.baumannii感染后6小时，caspase-11-/-小鼠BALF中IL-1β含量低于caspase-11+/+小鼠;A.baumannii感染后24及72小时，caspase-11-/-小鼠BALF中IL-1β含量高于caspase-11+/+小鼠。③A.baumannii感染后6、24及72小时，caspase-11-/-小鼠BALF中IL-6和TNF-α含量高于caspase-11+/+小鼠。
　　4、IL-1α中和性抗体抑制caspase-11+/+小鼠A.baumannii感染初期肺部中性粒细胞浸润和细菌清除。①IL-1α中和性抗体预处理降低A.baumannii感染6小时后caspase-11+/+小鼠BALF中性粒细胞数及肺组织MPO活性;IL-1β中和性抗体预处理对此没有明显影响。②IL-1α中和性抗体预处理增加A.baumannii感染6小时后caspase-11+/+小鼠BALF及肺组织菌落数;IL-1β中和性抗体预处理对此没有明显影响。
　　5、Caspase-11缺失加重A.baumannii感染持续阶段小鼠肺部病理改变。A.baumannii感染后6及24小时，caspase-11-/-小鼠肺部炎性细胞浸润及病理改变轻于caspase-11+/+小鼠;A.baumannii感染后72小时，caspase-11-/-小鼠肺部炎性细胞浸润及病理改变明显重于caspase-11+/+小鼠。
　　6、NLRP3抑制剂减轻A.baumannii感染持续阶段caspase-11-/-小鼠肺部病理改变。①A.baumannii感染后24小时，caspase-11-/-小鼠肺部组织caspase-1和NLRP3表达均显著高于caspase-11+/+小鼠。②NLRP3抑制剂MCC950处理减轻感染后72小时caspase-11-/-小鼠肺部病理改变。
　　7、Caspase-11缺失导致小鼠易感A.baumannii，但耐受A.baumannii LPS败血症。①在5×108A.baumannii感染时，caspase-11-/-小鼠生存率显著低于野生型小鼠。②A.baumannii LPS (50mg/kg)引起败血症时，caspase-11-/-小鼠生存率显著高于野生型小鼠。
　　结论:
　　1、Caspase-11在A.baumannii感染初期参与了肺部中性粒细胞募集和细菌清除，其潜在机制与caspase-11诱导的IL-1α释放有关。
　　2、Caspase-11缺陷增加了A.baumannii易感性，引起更严重的肺部病理异常，其机制与细菌负荷增加导致NLRP3炎性体信号通路异常激活有关。
　　3、Caspase-11缺陷增加了对A.baumannii败血症的耐受性，反映了caspase-11介导的信号通路过度激活可促进A.baumannii败血症的发生。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料和方法

2．1 主要器材耗材、试剂和仪器

2．2 实验方法

3 结果

3．1 A．baumannii体外激活小鼠BMDM非典型和典型炎性体信号通路

3．2 Caspase-11缺失损害A．baumannii肺部感染初期中性粒细胞募集和细菌清除

3．3 Caspase-11缺失抑制A．baumannii肺部感染小鼠IL-1α分泌

3．4 IL-1α阻断抑制caspase-11+／+小鼠A．baumannii感染初期肺部中性粒细胞募集和细菌清除

3．5 Caspase-11缺失加重A．baumannii感染持续阶段小鼠肺部病理改变

3．6 NLRP3抑制剂减轻A．baumannii感染持续阶段caspase-11-／-小鼠肺部病理改变

3．7 Caspase-11缺失导致小鼠易感A．baumannii，但耐受A．baumannii LPS败血症

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 炎性体信号通路

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历