microRNA-31对HIV感染T细胞活化的调控作用及机制研究

摘要

目的：人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染人体后会导致严重的细胞免疫损伤。T细胞是机体免疫系统充分发挥细胞免疫及免疫调节作用的主要成分，也是HIV感染中最重要的效应细胞，但是HIV感染使得T细胞免疫功能在感染早期就出现了功能障碍。与慢性免疫激活不同，T细胞的有效活化是T细胞增殖、分化，进一步发挥细胞免疫效应的基础，对于HIV急性期/早期感染阶段的有效活化受损研究较少且机制尚不明确。T细胞的有效活化依赖于双信号及细胞因子的共同作用，TCR与MHC复合结构特异性结合后，CD3将识别的抗原信息向细胞内传导，启动细胞的活化过程，最终T细胞分化为效应细胞发挥细胞免疫效应。其中T细胞有效活化的信号传导通路主要包括Ras-mapk(mitogen-activated protein kinase)通路、IP3-Ga(Inositol Trisphosphate-Calcium)通路及PKC（Protein kinase C）通路，信号传导的最终结果是活化了某些蛋白分子，被活化的蛋白质在构型上发生变化，使其具备了转录因子的功能。AP-1(Activator protein1)、NFAT(Nuclear factor of activated T-cells)、NF-κB(NuclearFactor kappa B)分别是三条信号通路活化的转录因子，这些转录因子通过作用于某些特殊的基因，最终引起细胞功能的改变。CD69是T细胞最早期的活化标志，在静息淋巴细胞上不表达，并且CD69可以很好的预测T细胞的增殖、分化、分泌等功能，被认为是评价T细胞有效活化能力的最快速、最常用、最典型的指标。microRNA可以精确而有效地调控很多的生物进程，同样也参与了T细胞免疫应答的调控，miR-155、miR-181c、miR-9均参与调控T细胞的活化反应，miRNA是否参与HIV感染早期有效免疫活化不清楚。HIV感染会影响microRNA的表达谱发生变化，实验室前期研究发现HIV快速进展者感染早期miR-31明显低表达，过表达miR-31可以上调CD4+T细胞表面CD69(Cluster of Differentiation69)的表达。本课题探究了miR-31与HIV感染有效活化反应能力受损的关系以及miR-31对T细胞有效活化(CD69)的调控作用及作用机制，目前尚未见报道。研究结果显示，HIV感染者T细胞有效活化反应能力受损与感染者中miR-31的低表达有关，并且miR-31可以调控Ras-MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号通路促进ERK1/2(Extracellular Signal-regulated Kinase-1/2)磷酸化来进一步促进T细胞的有效活化。而Ras-MAPK信号通路中的负调控因子KSR2(Kinasesuppressors of Ras2)和DUSP7（Dual-specificity phosphatases7）同时作为miR-31的靶基因在该病理反应中起负性调节作用。我们的研究为明确HIV感染的免疫受损及机制提供了新的信息。
　　方法：⑴miRNA过表达及敲减。PBMCs(Peripheral blood mononuclear cells)及Jurkat细胞中miR-31的过表达应用Amaxa电转仪转染实验组质粒GFP-pMax-miR-31及对照组质粒GFP-pMax-mock后置于37℃预温的10％FBS(Fetal bovine serum)的1640培养基中，37℃，5％CO2的培养箱中培养，6h后换液，培养至24h。293T细胞中miR-31的过表达应用miR-31特异性mimics类似物以2nmol为转染终浓度，通过HiPerFect转染试剂进行转染，含10％FBS的DMEM培养基培养至24h。PBMCs及23T细胞miR-31的敲减均采用miR-31特异性抑制剂antagomir，以500nmol为转染终浓度，用不含FBS的1640培养基或DMEM培养基孵育2h，后添加3倍体积的含10％FBS的1640培养基或DMEM培养基培养至72h(PBMCs)或24h(23T细胞)。⑵T细胞活化的流式细胞检测术。收取前期处理细胞，PBS（Phosphate buffer saline）洗两遍离心，弃净上清，用含10％FBS的1640培养基重悬，于包被anti-CD3/anti-CD28(0.5 ug/ml)的96孔板中刺激24h。避光染色(7AAD-Percp、CD3-PE-CY7、CD4-FITC/PE、CD8-APC、CD69-APC-CY7/PE)30min，离心洗涤细胞，用BD LSRⅡ流式细胞仪及BD FACSDiva TM软件检测并分析GFP+/CY3+的7-AAD-CD4+和7-AAD-CD8+T细胞表面CD69表达水平。⑶总RNA提取及逆转录。收取前期处理细胞，采用RNeasy Plus Mini Kit试剂盒（细胞数大于1×106个/ml）或RNeasy Micro Kit试剂盒（细胞数小于1×106个/ml），按照试剂盒说明书标准方法提取细胞总RNA。将纯化收集的总RNA立即用Primpscript(@) RTreagent kit试剂盒进行反转录，反转录体系参照试剂盒说明书要求，将反转录后的cDNA于-20℃保存以便进行过表达或敲减miR-31后靶基因的检测。⑷miRNA提取及逆转录。收取前期处理细胞，采用miRNeasy Mini Kit试剂盒（细胞数大于1×106个/ml）或miRNeasy Micro Kit试剂盒（细胞数小于1×106个/ml），按照试剂盒说明书标准方法提取细胞miRNA。将纯化收集的miRNA立即用Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit试剂盒进行反转录，反转录体系参照试剂盒说明书要求，将反转录后的cDNA于-20℃保存以便进行miR-31过表达或敲减水平的检测。⑸荧光实时定量PCR。将反转录后的cDNA样本，采用SYBR(@) Premix ExTaqTMⅡ试剂盒，定量体系参照试剂盒说明书要求，按照试剂盒说明书标准方法进行qRT-PCR检测。GAPDH、U6分别作为总RNA定量和miRNA定量的内参。⑹胞内蛋白磷酸化检测。Jurkat细胞通过Amaxa电转仪电转完成miR-31的过表达，过表达24h后，收取细胞PBS清洗，离心弃上清。细胞重悬，室温避光染色(violet-Live-dead)30min后，PBS清洗，离心弃上清，细胞用培养基重悬。将不同处理组分别置于96孔板中，anti-CD3&anti-CD28(2ug/ml)刺激15min、0min，加入等体积的预温固定液，37度固定10min。收取细胞，4度洗液清洗，离心弃上清。细胞重悬后，破膜剂冰上破膜30min，4度清洗，离心弃上清。避光4度染色(Alexa Fluor647-anti-ERK1/2，pT202/pY204)30min，4度清洗，离心弃上清后，细胞重悬，BD LSRⅡ流式细胞仪及BD FACSDiva TM软件检测并分析Live-dead-Jurkat细胞ERK1/2磷酸化水平。⑺统计学分析。用SPSS17.0统计软件及Graphpad Prism5.0软件进行统计学分析，相关的两组之间的比较用两样本的配对T检验或Mann-Whitney U检验，P＜0.05为有统计学意义。
　　结果：①HIV感染者中miR-31低表达。结合前期miRNA-microarray的结果发现，与健康人相比，HIV感染者中miR-31的表达明显减少(P=0.0018)。②miR-31调控T细胞的有效活化。鉴于miR-31的表达具有T细胞特异性，前期结果发现HIV感染者中miR-31低表达且T细胞有效活化反应能力受到损伤，我们将进一步探究miR-31对T细胞有效活化能力的调控作用。miR-31过表达上调T细胞表面CD69的表达。健康人PBMCs电转过表达miR-31后，实时定量检测miR-31过表达水平，同时TCR刺激24后，流式检测GFP+CD4+T细胞及GFP+CD8+T细胞表面CD69的表达。结果显示，与对照组相比，CD4+T细胞中miR-31有效过表达后(P=0.0013)，CD4+T细胞表面CD69表达明显上调(P=0.0022)，CD8+T细胞中miR-31有效过表达后(P=0.3494)，CD8+T细胞表面CD69表达明显上调(P=0.0170)。miR-31敲减下调T细胞表面CD69的表达。健康人PBMCs用antagomir敲减miR-31后，实时定量检测miR-31敲减后水平，同时TCR刺激24后，流式检测CY3+CD4+T细胞及CY3+CD8+T细胞表面CD69的表达。结果显示，与对照组相比，CD4+T中miR-31有效敲减后(P=0.0084)，CD4+T细胞表面CD69表达明显下调(P=0.0020)，CD8+T中miR-31有效敲减后(P=0.0113)，CD8+T细胞表面CD69表达明显下调(P=0.0397)。③miR-31靶向调控靶基因KSR2和DUSP7。通过生物信息学方法，DAVID软件进行信号通路分析，最终确立了靶点评分较高且负调控T细胞活化的miR-31的靶基因RASA1、KSR2、PAQR3、DUSP7。通过在293T细胞中过表达miR-31，24h后实时定量PCR检测miR-31及靶基因mRNA水平，miR-31有效过表达10倍左右(P=0.0302)，靶基因KSR2、DUSP7mRNA水平明显下调(P=0.0166，P=0.0439)，差异有统计学意义，靶基因RASA1、PAQR3 mRNA水平变化没有统计学意义。进一步在293T细胞中敲减miR-31，24h后实时定量PCR检测miR-31及靶基因mRNA水平，miR-31被有效敲减50％左右(P=0.0029)，靶基因KSR2、DUSP7 mRNA水平明显上调(P=0.0214，P=0.0296)，差异有统计学意义。④miR-31调控Ras-MAPK信号通路促进ERK1/2磷酸化。靶基因KSR2、DUSP7为Ras-MAPK信号通路中已知的负调控因子，我们将进一步探究miR-31是否通过调控该通路影响ERK1/2磷酸化来促进T细胞的有效活化。Jurkat细胞通过Amaxa电转仪电转完成miR-31的过表达，TCR刺激15min后，流式检测并分析ERK1/2磷酸化水平。结果显示，miR-31过表达可以明显促进ERK磷酸化水平(P=0.042)，差异有统计学意义。
　　结论：⑴HIV感染者中miR-31明显低表达。⑵miR-31促进T细胞表面CD69的表达，促进T细胞有效活化。⑶miR-31是通过调控Ras-MAPK信号通路促进ERK1/2磷酸化来促进T细胞有效活化的。⑷Ras-MAPK信号通路中的负调控因子KSR2和DUSP7同时作为miR-31的靶基因参与了负调控T细胞的有效活化。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1．1 研究对象

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 miRNA的过表达及敲减

2．2．2 T细胞活化的流式细胞检测术

2．2．4 miRNA提取及反转录

2．2．5 荧光实时定量PCR(qPCR)

2．2．6 蛋白磷酸化检测

2．2．7 统计学分析

3．1 HIV感染者miR-31低表达

3．2．1 miR-31过表达后上调T细胞表面CD69的表达

3．3．2 miR-31敲减后下调T细胞表面CD69的表达

3．3 miR-31靶基因预测

3．4 miR-31靶基因鉴定

3．5 miR-31调控Ras-MAPK通路促进ERK1／2磷酸化

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 microRNA调控T细胞活化的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历