切除修复交叉互补基因1(ERCC1)多态rs3212986与肺癌发生风险的关联及机制研究

摘要

目的:肺癌是目前世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤。因此，找寻到有效的遗传生物学标志具有重要意义。众所周知，DNA修复基因可以修复环境致癌因子所造成的DNA损伤从而防止肿瘤的发生，而炎症相关基因是肿瘤微环境的重要组成部分，为正常细胞的癌变及肿瘤细胞的侵袭和扩散提供条件。单核苷酸多态性(SNP)是广受关注的第三代遗传学标志，而miRNA结合位点上的SNP逐渐成为肿瘤易感性标志研究领域的热点。本研究对通过生物信息学选取的核苷酸切除修复(NER)、碱基切除修复(BER)、错配修复(MMR) DNA修复通路限速酶基因ERCC1、OGG1、MLH3以及炎症相关基因CD3EAP、PPP1R13L、STAT3的3'非翻译区(UTR)域候选SNP位点进行基因型检测，发现ERCC1 C8092A(rs3212986)多态与肺癌，尤其是吸烟型肺癌的发病风险相关联。同样地，在我们以往的研究中也发现ERCC1 rs3212986位点A等位基因对于BPDE-DNA加合物的修复起到重要作用。有趣的是，rs3212986位点位于ERCC13'UTR的同时也位于其反向互补重叠基因CD3EAP的编码区(CDS)。因此，为了进一步探索该位点的功能机制，阐明rs3212986多态是通过影响CD3EAP转录和/或翻译，和/或通过影响ERCC1转录后的miRNA调控而影响个体DNA修复酶的活性，进而成为一个预测肿瘤发生风险的重要生物学标志。
　　研究方法:首先，本研究从2014年10月至2015年10月，共收集来自中国医科大学第一临床医院初次确诊为肺癌患者的病例300例，并收集与病例年龄（±3岁）、性别相匹配的健康对照300例。知情同意后，记录基本人口学特征、既往病史、吸烟情况等信息，同时采集外周血5ml，用于DNA及RNA提取。根据NCBI网站筛选出目的基因3'UTR区的SNP位点以及这些SNP位点在人群中的最小等位基因频率（MAF值），并结合本研究样本量确定候选SNP位点。采用Taqman水解探针法检测300对肺癌病例及其健康对照靶基因的候选SNP位点的多态性，并分析各SNP位点基因多态与肺癌发病风险的关联，以及在混杂因素年龄、性别及吸烟状况分层下二者之间的关联。其次，在体外试验中通过分别构建ERCC1、CD3EAP两个基因rs3212986位点不同基因型的质粒，转染工具细胞HEK293T及人支气管上皮细胞16HBE，在明确施加环境致癌因子二羟二醇环氧苯并芘(BPDE)后，应用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)分别检测转染ERCC1、CD3EAP基因两组质粒的HEK293T和16HBE细胞的存活率，比较转染rs3212986不同基因型质粒的细胞间是否存在差异;同时通过改良彗星实验以及γH2AX免疫荧光实验分别比较rs3212986不同基因型的转染细胞之间DNA损伤修复能力的区别，综合分析rs3212986位点多态是通过影响CD3EAP，和/或ERCC1而影响个体DNA修复酶的活性。应用生物信息学软件RNA Structure预测rs3212986不同基因型之间ERCC1 mRNA二级结构的差异。最后，本研究分别检测肺癌及其癌旁组织中ERCC1转录水平与蛋白表达水平，并比较两者的一致性，应用生物信息学软件Targetscan及RNAhybird筛查出绑定在ERCC13'UTR区的候选miRNA，并检测33对肺癌病例及与其匹配的健康对照血浆中和20例肺癌及其癌旁组织中的候选miRNA表达水平。随后分别构建含有ERCC1基因3'UTR区野生型和突变型（包括rs3212986位点突变型和ERCC13'UTR序列突变型）的萤火虫荧光质粒，并将该质粒分别与miRNA模拟物或miRNA阴性对照共转染入HEK293T细胞，分析rs3212986多态是否影响目的miRNA对ERCC13'UTR的绑定作用。将miRNA模拟物或miRNA阴性对照转染人肺腺癌细胞A549，并分别比较二者对ERCC1转录和翻译水平的影响。
　　结果:1、根据本研究样本量及目的基因MAF值确定的候选SNP位点为:ERCC1 rs3212986、rs2336219、rs735482, MLH3 rs108621, OGG1 rs1052133,PPP1R13L rs6966，CD3EAP rs1007616，STAT3rs3744483，在300对病例对照研究中发现ERCC1 rs3212986位点的基因多态性与肺癌发生风险有关，其AA基因型携带者比CC基因型患肺癌的风险高(OR=2.061;95％CI:1.057～4.017)。并且经分层分析后，在男性人群中仍可发现ERCC1 rs3212986的多态性与肺癌发病风险相关联，其AA基因型携带者比CC基因型携带者患肺癌的风险高(OR=3.246;95％CI:1.375～7.663)。另外发现在女性人群中OGG1 rs1052133和STAT3rs3744483位点的多态性与肺癌的易感性相关，OGG1 rs1052133 CC基因型携带者比GG基因型携带者患肺癌的风险高(OR=2.588;95％CI:1.035～6.474)，STAT3 rs3744483位点杂合型TC女性携带者比TT基因型女性携带者患肺癌的风险高(OR=1.717，95％CI:1.119～2.634);经年龄分层分析发现，在年龄小于60岁的人群中ERCC1 rs735482位点的多态性与肺癌发生风险相关，其杂合型AC携带者相对于AA基因型对肺癌的患病起到保护作用(OR=0.560;95％CI:0.336～0.934)。在吸烟暴露确切的186对肺癌病例及其健康对照的分层分析中发现，吸烟人群中ERCC1 rs3212986 AA基因型携带者比CC基因型携带者患肺癌的风险高(OR=3.510;95％CI:1.157～10.645)，而在非吸烟人群中并未发现这一现象。2、将ERCC1(CDS+3'-UTR）和CD3EAP(CDS)包含rs3212986两种不同基因型的质粒分别同时转入293T或16HBE细胞中，转染24h后在荧光显微镜下可见表达荧光蛋白（转染ERCC1质粒表达绿色荧光蛋白，转染CD3EAP表达红色荧光蛋白）的转染细胞。应用Western blot鉴定ERCC1、CD3EAP在HEK293T及16HBE中的蛋白表达情况，过表达ERCC1或CD3EAP两种不同基因型质粒的细胞蛋白表达量均高于转染空质粒和未处理的细胞，证实细胞转染成功;给予转染细胞不同剂量BPDE处理后，分别在24h及处理24h后换液再孵育24h两个时间点检测细胞存活率，结果显示，对于转染细胞293TERCC1（CC)与293TERCC1(AA)在BPDE处理24h时，在BPDE浓度大于4μM开始出现显著差异(P＜0.05)。并且经过24h的恢复后这种差异更加明显(P＜0.05)。对于转染细胞293TCD3EAP(CC)与293TCD3EAP(AA)在BPDE处理后，除了在4μM BPDE处理24h和2μM BPDE处理24h后换液继续培养24h外(P＜0.05)，其他时点及剂量尚无明显区别。但CD3EAP过表达质粒与空质粒转染细胞相比，在各时点及剂量均有一定差异，上述结果在转染的16HBE细胞中同样被印证;γH2AX免疫荧光实验结果显示，对于转染细胞293TERCC1(CC)与293TERCC1(AA)在BPDE处理后，293TERCC1(CC)的损伤修复能力明显优于293TERCC1(AA)(P＜0.05)。而CD3EAP的过表达细胞与空质粒转染细胞相比，损伤修复能力增强(P＜0.05)，但是293TCD3EAP(CC)与293TCD3EAP(AA)两种转染细胞间FOCI数量并无显著性差异。上述结果在转染的16HBE细胞中同样被印证;彗星实验结果也验证了ERCC1rs3212986 CC基因型过表达细胞的DNA损伤修复能力优于AA基因型（P＜0.05），CD3EAP的过表达细胞的彗尾短于空质粒转染细胞(P＜0.05)，证明对于BPDE的损伤修复能力较强，但是293TCD3EAP(CC)与293TCD3EAP(AA)两种转染细胞间并无显著性差异。上述结果在转染的16HBE细胞中同样被印证。通过对ERCC1mRNA的二级结构预测发现rs3212986多态可能通过改变包括其在内的6个重复“GCT”组成的折叠的茎-环结构，而对DNA修复能力产生关键性的影响。3、通过分别检测15例肺癌组织及其癌旁组织的ERCC1 mRNA及蛋白的表达情况，发现二者的不一致性，从而提示rs3212986多态可能通过影响ERCC1转录后miRNA调控而发挥功能;根据Targetscan和RNAhybrid网站筛查结果和文献阅读选择miR-122，miR-18a，miR-615-5p，miR-214，miR-15a，miR-16，miR-4298，miR-324-3p和miR-1913进行后续实验;分别检测20例肺癌组织及其癌旁组织中和33对肺癌患者血浆及与其匹配的健康对照血浆中9个候选miRNA的表达水平，结果显示，miR-15a和miR-16癌旁中的表达量高于癌组织中，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。MiR-15a，miR-16，miR-18a和miR-4298的表达量在健康对照血浆中高于肺癌患者血浆，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。综合分析认为miR-15a和miR-16可能作为肿瘤抑制剂结合在ERCC13'UTR上，由于miR-15a和miR-16均来源于miR-15家族并具有同变性，因而我们以miR-15a为例进行后续试验。另外，鉴于miR-4298首次被发现在肺癌病例对照血浆中存在差异，并且生物信息学预测显示miR-4298与ERCC13'UTR区的结合最小自由能达到-40.8 kcal/mol，因此选择miR-15a和miR-4298进行双荧光素酶实验验证，结果发现miR-15a和miR-4298均结合在ERCC13'UTR，但只有miR-15a在ERCC13'UTR区的绑定会受到rs3212986多态性的影响，另外将miR-15a转染A549细胞发现，miR-15a对于ERCC1 mRNA的表达只有比较微弱的影响，而却可以明显降低ERCC1蛋白表达。证明miR-15a对ERCC1的调控作用发生在转录后翻译阶段。
　　结论:1、本研究应用肺癌病例对照研究提出ERCC1 C8092A(rs3212986)可能作为一个有价值的肿瘤易感性生物标志预测肺癌尤其是吸烟型肺癌的发病风险。2、本研究明确位于ERCC1和CD3EAP重叠区域的C8092A(rs3212986)多态主要通过影响ERCC1的表达从而对环境致癌因子引起的DNA损伤修复发挥作用。3、本研究首次提出ERCC1 C8092A(rs3212986)多态通过影响miR-15a对ERCC1转录后的调控作用而影响个体DNA修复酶活性。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：ERCC1，OGG1，MLH3，CD3EAP，PPP1R13L和STAT33’ UTR区SNP与肺癌发病风险的病例对照研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 结果

3．1 确定本次研究的SNP位点

3．2 研究对象的基本情况

3．3 肺癌发病风险与靶基因3’UTR区SNP的关联性分析

3．4 肺癌发病风险与靶基因3’UTR区SNP关联的性别分层分析

3．5 肺癌发病风险与靶基因3’UTR区SNP关联的年龄分层分析

3．6 肺癌发病风险与靶基因3’UTR区SNP关联的吸烟分层分析

4 讨论

第二部分：基于细胞转染模型研究ERCC1、CD3EAP基因重叠区域C8092A(rs3212986)多态与7，8-二羟-9，10-二醇-环氧苯并芘(BPDE)所致DNA损伤修复的关联

5 前言

6 材料与方法

6．1 主要试剂和仪器

6．2 实验方法

7 结果

7．1 根据rs3213986设计质粒定位并获得转染细胞

7．2 ERCC1在各转染细胞中的表达

7．3 BPDE对各转染细胞细胞活性的影响

7．4 彗星实验测定ERCC1转染HEK293T细胞DNA损伤修复能力

7．5 彗星实验测定CD3EAP转染HEK293T细胞DNA损伤修复能力

7．6 彗星实验测定转染16HBE细胞DNA损伤修复能力

7．7 γH2AX免疫荧光实验测定转染HEK293T细胞DNA操作修复能力

7．8 γH2AX免疫荧光实验测定转染16HBE细胞DNA损伤修复能力

7．9 Rs3212986影响ERCC1 mRNA二级结构

8 讨论

第三部分：与ERCC1 C8092A(rs3212986)多态相关的miRNA调控及其意义

9 前言

10 材料与方法

10．1 主要试剂和仪器

10．2 实验方法

11 结果

11．1 ERCC1 mRNA与蛋白表达在肺癌组织与其癌旁组织中具有不一致性

11．2 以ERCC1 3’UTR为调控靶的miRNA筛查

11．3 miRNA在血浆中的表达

11．4 miRNA在肺癌组织中的表达

11．5 miR-15a，mi-4298的双荧光素酶验证

11．6 转染miR-15a对ERCC1表达的影响

12 讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 调控核苷酸切除修复系统基因的miRNA及多态性与肿瘤易感性研究的相关进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历