调节性T细胞亚群在溃疡性结肠炎中的变化研究

摘要

目的：炎症性肠炎(intestinal bowel disease，IBD)，分为溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，发病率为6-8/1000000/每年以及4/100000/每年，其发病率越来越高，成为一种全球化疾病。导致溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的主要因素有环境因素，遗传因素，肠道共生菌群的组分以及免疫应答。其中免疫系统是四种介导炎症性肠炎发生的主要因素。主要由T淋巴细胞和B淋巴细胞组成的适应性免疫系统也被认为在IBD的致病过程中发挥着至关重要的作用。早期的研究表明，克罗恩氏病是一种TH1的状态。随着进一步研究发现，不只是TH1/TH2细胞，TH17细胞和调节性T细胞与炎性细胞的失衡会导致炎症性肠炎的发生。CD4FOXP3+调节性T细胞几乎在每个器官都存在，肠道FOXP3+调节性T细胞通过多种机制调控粘膜免疫反应。调节性T细胞主要分为两类大的亚群，胸腺来源的天然调节性T细胞与外周诱导的调节性T细胞，进一步可以细分为天然调节性T细胞，Tr1细胞，CD127-调节性T细胞和CD8+调节性T细胞。这四种亚群的调节性T细胞被报道在抑制效应性T细胞发挥着重要的作用。目前为止，仍然缺少研究系统地描述调节性T细胞亚群在溃疡性结肠炎中所发挥的作用，本研究通过构建小鼠DSS结肠炎模型，探究不同亚群的调节性T细胞在DSS诱导结肠炎的急性期和慢性期的比例，分析不同程度的溃疡性结肠炎病人外周血调节性T细胞的比例，验证不同亚群的调节性T细胞在溃疡性结肠炎发生发展的不同阶段的变化，为临床上通过干预调节性T细胞功能治疗溃疡性结肠炎提供理论基础。
　　方法：28只BALB/c小鼠（7-8周龄，雄性）连续给予5天2.5％DSS水溶液，之后连续给予5天蒸馏水自由饮用。此为一个循环，此循环重复3次。并在第10天、第20天、第30天进行实验检测。在诱导期间每天同一时间对IBD小鼠进行DAI评分，检测体重来验证模型。取末梢血标本分离PBMCs，流式细胞仪检测Treg细胞亚型;分离血清ELISA法检测血清中的细胞因子水平;取结肠组织，提取肠黏膜固有层淋巴细胞，流式细胞仪检测Treg细胞亚型;取肠系膜淋巴结，流式细胞仪检测Treg细胞亚型。同时收集辽宁医学院附属第一医院消化科炎症性肠病患者内镜中心做电子肠镜检34例（符合临床DAI评分并且电子肠镜确诊为炎症性肠病的患者，为入组标准），在发病的24小时之内，当天清晨采集各组患者5-10 ml空腹静脉血于肝素钠抗凝的试管中，用于流式细胞术和RT-PCR检测。采集2ml血于未加肝素钠抗凝剂管，静置后离心，并取血清于-80℃冰箱保存，用于ELISA检测炎性细胞因子。肠镜标本部分制备石蜡切片用于形态学观察及免疫组化、组织病理检测，部分新鲜组织提取蛋白及及用于RT-PCR检测的mRNA。
　　结果：⑴模型组小鼠自饮用DSS水第3天开始出现粪便松散、粪便含水量显著增加、体重下降急性结肠炎的症状表现，随着喂水时间延长，模型组小鼠出现毛色变暗，活动显著减少，精神状态不佳等症状。模型组DAI评分在DSS饮用水喂水7天后与基线即有统计学差异(3.5±0.9 vs1.0±0.0，p=0.000)，而对照组小鼠DAI评分在饮用正常水7天内均无显著变化。DSS诱导小鼠急性模型第7天，模型组的结肠呈现出多灶性浅溃疡，表现为结肠上皮细胞脱落，结肠的粘膜不完整，隐窝小体的结构消失。大部分正常的腺体结构丧失，在粘膜、粘膜下层可见浸润的炎性细胞，主要以中性粒细胞和淋巴细胞为主，上皮内杯状细胞显著减少。改用正常饮用水1周后，不再有肉眼可见的血便，DAI评分也随之降低，但仍然显著高于对照组。2周后只见较为松散的大便，21天后小鼠的活动程度以及精神状态基本恢复正常。停止DSS后的第5天，模型组小鼠结肠隐窝小体的结构部分几乎全部消失，大量杯状细胞发生丢失，停止DSS后的第7天，即第19天，重新可见修复再生的隐窝小体结构以及杯状细胞，虽然仍有炎性细胞的浸润，但主要集中在粘膜下层，并且主要以单核细胞、淋巴细胞为主，第26天后，虽然结肠组织的部分结构已经恢复，但是组织中仍然存在大量的炎性细胞在粘膜以及粘膜下层的部位浸润。⑵在饮用DSS水诱导小鼠慢性急肠炎的第1，4天，固有层、外周血以及肠系膜淋巴结Foxp3+IL-10+TGF-β+天然调节性T细胞比例相较于基线值显著降低，停止DSS饮水后，天然调节性T细胞的比例相较于基线，显著上调，在第7天时比例上升到高峰期，随着肠炎的病理恢复，天然性调节性T细胞的比例逐渐下降。到第30天，结肠的病理完全修复后，天然调节性T细胞比例渐恢复至正常水平。⑶在饮用DSS水诱导小鼠慢性急肠炎的第1天，固有层与外周血诱导性Tr1细胞比例相较于基线值显著降低，第4天恢复至正常水平，停止DSS饮水后，固有层诱导性Tr1细胞的比例相较于基线水平显著降低，一直处于较低比例。肠系膜淋巴结中，与外周血以及固有层淋巴细胞中Tr1比例变化表现不同，无论是处于急性期肠炎还是慢性化模型中，Tr1细胞的比例与基线值均无显著差异。⑷在饮用DSS水诱导小鼠性性急肠炎的第1，4天，固有层与外周血以及肠系膜淋巴结中CD127-Treg细胞比例相较于基线值显著降低，停止DSS饮水后，固有层CD127-Treg恢复至基线水平。⑸在饮用DSS水诱导小鼠慢性急肠炎的第1，4天，固有层CD8+ Treg细胞比例相较于基线值无明显变化，停止DSS饮水后，固有层CD8+ Treg细胞在第7天先显著上升，后逐渐恢复至基线水平，至第30天肠炎恢复后，固有层CD8+ Treg细胞降低至显著低于基线水平。而外周血与肠系膜淋巴结中，无论是处于急性期肠炎还是慢性化模型中，CD8+ Treg细胞的比例与基线值均无显著差异。⑹相较于正常对照组而言，溃疡性结肠炎患者炎性细胞因子Eotaxin，IL-17A以及IL-25的表达水平显著上调(Eotaxin:92.2 pg/ml±6.7 vs146.3 pg/ml±16.2，p=0.006;IL-17A:1.4 pg/ml±0.5 vs4.8 pg/ml±0.9,p=0.008; IL-25:1.0 pg/ml±0.3 vs2.3 pg/ml±0.4,p=0.04)。而炎性细胞因子TSLP, MMP-2和MMP-9的表达水平显著下调(TSLP:17.6pg/ml±0.6 vs0.9 pg/ml±0.3,p＜0.0001;MMP-2:192.6 pg/ml±22.3 vs75.1 pg/ml±12.3,p=0.0004; MMP-9:51856 pg/ml±11723 vs4072 pg/ml±860.5, p=0.04)。⑺急性期溃疡性结肠炎患者相较于正常对照组，外周血中天然调节性T细胞比例显著降低(5.2±0.7％ vs0.7±0.1％，p＜0.0001)，而恢复期结肠炎患者相较于急性期溃疡性结肠炎患者，外周血中天然调节性T细胞比较显著增加(0.7±0.1％ vs2.0±0.7％，p=0.006)。外周血中CD127-调节性T细胞比例无显著变化(58.5±4.9％ vs52.6±10.1％，p=0.63)，而恢复期结肠炎患者相较于急性期溃疡性结肠炎患者，外周血中CD127-调节性T细胞也无显著增加(52.6±10.1％ vs58.8±17.1％，p=0.75)。外周血中Tr1细胞比例无显著变化(0.02±0.01％ vs0.06±0.02％，p=0.19)，而恢复期结肠炎患者相较于急性期溃疡性结肠炎患者，外周血中Tr1细胞也无显著增加(0.06±0.02％ vs0.03±0.01％，p=0.35)。外周血中CD8+调节性细胞比例显著减少(2.1±0.2％ vs0.3±0.2％，p＜0.0001)，而恢复期结肠炎患者相较于急性期溃疡性结肠炎患者，外周血中CD8+调节性细胞也无显著增加(0.3±0.2％ vs0.04±0.02％，p=0.26)。
　　结论：①成功构建了小鼠急性肠炎慢性化的动物模型。②小鼠慢性化肠炎固有层、外周血和肠系膜淋巴结中Foxp3+IL-10+TGF-β+天然调节性T细胞比例均呈现炎症期先降低而后升高趋势，伴随炎症的恢复则逐渐下降，前二者中的该T细胞亚群比例可恢复到正常水平，而后者仍保持在较高水平。提示Foxp3+IL-10+TGF-β+调节性T细胞亚群可能参与了小鼠实验性肠炎炎症的恢复过程。③小鼠慢性化肠炎固有层、外周血和肠炎肠系膜淋巴结中Foxp3-IL-10+TGF-β-Tr1细胞比例在炎症发生和恢复过程中始终处于正常及较低水平，提示该调节性T细胞亚群可能未参与小鼠实验性肠炎炎症的发生、发展及恢复过程。④小鼠慢性化肠炎固有层、外周血和肠系膜淋巴结中CD127-Treg细胞比例在小鼠实验性炎症早期呈下降趋势，但损伤修复过程可迅速恢复到正常水平，提示该调节性T细胞亚群可能未参与小鼠实验性肠炎炎症的发生、发展及恢复过程。⑤小鼠慢性化肠炎固有层CD8+ Treg细胞亚群比例于实验炎症初期下降，停止炎症刺激后则显著升高，炎症恢复后呈现下降趋势;肠系膜淋巴结和外周血中CD8+ Treg细胞比例于炎症发生、发展及恢复过程中均未显示明显变化。提示固有层CD8+ Treg细胞可能参与了实验性肠炎的炎症恢复过程，而肠系膜淋巴结和外周血中该细胞亚群可能与此无关。⑥急性期溃疡性结肠炎患者外周血中Foxp3+IL-10+TGF-β+天然调节性T细胞比例显著降低，而恢复期则显著增加，提示该调节性T细胞亚群于炎症恢复期细胞增殖并参与促进肠道的损伤修复过程。⑦溃疡性结肠炎患者急性期和恢复期外周血CD127-Treg和Foxp3-IL-10+TGF-β-Tr1二种调节性T细胞比例均未显示明显变化，提示CD127-调节性T细胞可能与溃疡性结肠炎的炎症发生、发展与恢复无关。⑧溃疡性结肠炎患者急性期外周血中CD8+调节性T细胞比例显著减少，恢复期可伴随炎症恢复，呈现恢复正常比例状态。提示CD8+调节性T细胞亚群可能并未参与炎症的发生、发展及恢复过程。其急性期下降的原因尚有待进一步弄清。⑨溃疡性结肠炎患者血清中炎性细胞因子Eotaxin，IL-17A以及IL-25的表达水平显著上调，TSLP, MMP-2和MMP-9的表达水平显著下调，提示炎性细胞因子IL-17，IL-25以及Eotaxin可能参与促进急性肠炎的发生过程。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 实验动物

2．2 病人基本信息

2．3 实验仪器

2．4 实验材料与方法

2．4．1 小鼠急性肠炎与慢性肠炎模型的构建

2．4．2 DAI评分

2．4．3 临床研究：UC和CD患者血液标本及肠道组织病理标本的检测

2．4．4 血清的分离与保存

2．4．7 小鼠肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞分离

2．4．8 肠粘膜固有层淋巴细胞的提取

2．4．9 淋巴细胞体外培养与刺激

2．4．10 流式细胞术检测细胞因子以及FoxP3转录因子的表达

2．4．11 ELISA法检测血清中细胞因子水平

2．4．12 炎症性肠组织病理标本检测

2．4．13 小鼠炎症性肠组织病理学分析

2．4．14 统计学结果分析

3 实验结果

3．1 小鼠急性肠炎模型的成功建立

3．1．1 小鼠急性肠炎粪便含水量、体重以及DAI评分的变化

3．1．2 小鼠急性肠炎结肠组织病理学结果

3．2 小鼠急性肠炎慢性化模型的成功建立

3．2．1 小鼠慢性化肠炎基本活动状态以及DAI评分的变化

3．2．2 小鼠慢性化肠炎病理学结果

3．3 小鼠急性肠炎慢性化模型中调节性T细胞亚群变化

3．3．2 小鼠慢性化肠炎Foxp3-IL-10+TGF-β-Tr1细胞比例变化

3．3．3 小鼠慢性化肠炎CD127- Treg细胞比例变化

3．3．4 小鼠慢性化肠炎CD8+ Treg细胞比例变化

3．4 溃疡性结肠炎患者血清中炎性细胞因子的表达水平

3．5 溃疡性结肠炎患者外周血调节性T细胞亚群比例变化

3．5．3 溃疡性结肠炎患者外周血Foxp3-IL-10+TGF-D-Tr1细胞比例变化

3．5．4 溃疡性结肠炎患者外周血CD8+调节性T细胞比例变化

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Treg和Breg与炎症性肠病

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历