skMLCK及CaM在LPS诱导的ARDS导致膈肌收缩力下降中的作用

摘要

目的:通过腹腔内注射LPS(Lipopolysaccharide)构建大鼠急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome ARDS)动物模型，采用实时定量荧光聚合式酶链反应(Real-Time PCR)的实验方法检测ARDS导致大鼠膈肌收缩力下降中骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle light chain kinase skMLCK)及钙调蛋白(calmodulin CaM)mRNA的表达水平的变化及其是否与诱导时间有关。同时将skMLCK mRNA及CaM mRNA的表达水平与前期工作基础测得的膈肌收缩力进行相关性分析，初步研究skMLCK及CaM mRNA表达水平的变化是否在LPS诱导ARDS导致膈肌收缩力下降中的发挥作用，并进一步探讨ARDS导致呼吸衰竭膈肌收缩力下降的分子机制。
　　方法:将32只健康且月龄在2月±1周的雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠(250±20)g随机分为对照组及实验组，每组大鼠均为8只(n=8)。其中对照组大鼠腹腔内注射生理盐水(10ml/day)，实验组大鼠经腹腔内注射LPS(8mg/kg/day)并将实验组随机分为24h组、48h组及7d组。其中，LPS24h组在腹腔内注射LPS后观察24h;LPS48h组腹腔注射LPS，24h后再次向大鼠腹腔注射LPS共观察48h;7d组腹腔注射LPS后观察24h后再腹腔注射LPS共观察7天。在构建ARDS动物模型期间分别观察各组大鼠的行为表现及一般状态（呼吸、血压等）等情况并记录。所有组别大鼠待观察实验点结束后于10％水合氯醛(3ml/100g)腹腔麻醉后，抽取各组大鼠颈动脉血测定血气并计算氧合指数。迅速取出各组大鼠膈肌组织并将其剪成60mg左右大小膈肌条置于EP管中，并置于-80℃冰箱保存。待膈肌取出后，用加入肝素的生理盐水经右心室注入肺动脉内对肺血管床进行冲洗，最终取出各组大鼠肺组织，每只大鼠均取出右肺上叶测量干湿重并计算湿/干重比，留取剩余肺组织部分于-80℃保存，部分于组织固定液中固定。最终应用苏木精及伊红（hematoxylin and eosin HE）染色在光镜下观察各组大鼠肺组织病理形态，通过实时荧光定量聚合式酶链反应(real-time PCR)实验技术方法分别测定各组大鼠膈肌组织skMLCK及CaM mRNA表达水平并与对照组进行比对，最终通过统计学软件运用相应统计学方法对数据进行统计及分析。
　　结果:1. ARDS动物模型:
　　1.1.大鼠行为学表现:
　　1.1.1.对照组大鼠一般状态良好，饮食、饮水正常，毛发发育正常，活动力强，呼吸及血压平稳。
　　1.1.2 LPS各实验组的大鼠腹腔注射LPS后均出现精神萎靡、毛发无光泽、反应迟钝、厌食、厌水、畏寒、呼吸急促及血压降低等表现。
　　1.1.2.1.呼吸频率:LPS各实验组大鼠呼吸频率明显比对照组增快且差异具有统计学意义（P＜0.05）;LPS各实验亚组之间呼吸频率差异无明显统计学意义(P＞0.05)。
　　1.1.2.2.平均动脉压(MAP):LPS各实验组大鼠平均动脉压明显比对照组降低且差异具有统计学意义(P＜0.05);LPS各实验亚组之间差异无明显统计学意义（P＞0.05）。
　　1.2.氧合指数(PO2/FiO2):LPS各实验组大鼠氧合指数明显比对照组降低且差异具有统计学意义(P＜0.05);LPS各实验亚组之间氧合指数差异无明显统计学意义(P＞0.05)。
　　1.3肺损伤评分:LPS各实验组肺组织损伤评分较对照组明显升高且差异具有明显统计学意义(P＜0.05);LPS各实验亚组之间肺损伤评分比较差异具有明显统计学意义(P＜0.05)，48h肺损伤评分最高，表明在48h可能对肺组织的损伤最重，7d组肺损伤评分较24h低，表明在7d时可能出现逐渐恢复的过程。
　　1.4膈肌收缩功能:
　　1.4.1.等张收缩力标准化/膈肌横截面积(Pt/CSA):LPS各实验组与对照组比较，LPS各实验组(Pt/CSA)下降且差异具有明显统计学意义(P＜0.05)。
　　1.4.2.最大强直收缩力/膈肌横截面积(P0/CSA):LPS各实验组与对照组比较，LPS各实验组(P0/CSA)下降且差异具有明显统计学意义(P＜0.05)。
　　2、膈肌skMLCK mRNA表达:LPS各实验组膈肌skMLCK mRNA表达均比对照组低且差异具有明显统计学意义（P＜0.05），LPS各亚组间(LPS24h、LPS48h、LPS7d组)膈肌skMLCK mRNA表达差异无明显统计学意义(P＞0.05)，即与LPS诱导时间无关。
　　3、 skMLCK mRNA的表达及膈肌收缩力进行相关性分析。将skMLCK mRNA表达与等张收缩力标准化/膈肌横截面积（Pt/CSA）进行相关性分析，得出膈肌skMLCK mRNA的低表达与膈肌等张收缩力标准化/膈肌横截面积(Pt/CSA)呈正相关关系(r=0.53 P＜0.05);将膈肌skMLCK mRNA的表达与最大强直收缩力/膈肌横截面积(P0/CSA)进行相关性分析，得出膈肌skMLCK mRNA的低表达与最大强直收缩力/膈肌横截面积(P0/CSA)两者呈正相关关系(r=0.57 P＜0.05)。
　　4、 CaM mRNA的表达:与对照组相比，LPS各实验组膈肌CaM mRNA的表达均比对照组高，差异具有明显统计学意义(P＜0.05)，各实验组之间(LPS24h、LPS48h、LPS7d组)膈肌CaM mRNA表达无明显统计学差异（P＞0.05），即与LPS诱导时间无关。
　　5、 CaM mRNA的表达及膈肌收缩力进行相关性分析。通过统计学软件SPSS22.0对CaM mRNA的表达及膈肌收缩力进行相关性分析。将CaM mRNA的表达与等张收缩力标准化/膈肌横截面积(Pt/CSA)进行相关性分析，得出膈肌CaMmRNA的高表达与膈肌等张收缩力标准化/膈肌横截面积(Pt/C SA)呈负相关关系（r=-0.41 P＜0.05）。将膈肌CaM mRNA的高表达与最大强直收缩力/膈肌横截面积(P0/CSA)进行相关性分析，得出膈肌CaM mRNA的高表达与最大强直收缩力/膈肌横截面积(P0/CSA)两者呈负相关关系(r=-0.43 P＜0.05)。
　　6、 skMLCK mRNA与CaM mRNA表达的相关性
　　通过对膈肌CaM及skMLCK mRNA表达进行相关性分析结果提示:膈肌CaM mRNA的高表达与skMLCK mRNA的低表达呈负相关关系(r=-0.49 P＜0.05)。
　　结论:skMLCK mRNA的低表达及CaM mRNA的高表达在LPS诱导的ARDS导致大鼠膈肌收缩力下降中占有非常重要的作用。CaM-skMLCK信号通路参与LPS诱导的ARDS导致的膈肌收缩力下降。skMLCK mRNA的低表达通过诱导刺激CaM mRNA的代偿性的高表达，其可能作为一种代偿性机制在维持膈肌收缩力中占有非常重要的作用，同时CaM mRNA的高表达又通过调控膈肌细胞内其他的一些生物过程最终出现失代偿膈肌收缩力下降。

目录

声明

摘要

英文缩略词

1 前言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3．1 大鼠的行为学表现

3．2 各组氧合指数(PO2／FiO2)

3．3 大鼠肺组织的病理改变

3．4 肺损伤病理组织学评分

3．5 膈肌收缩力测定

3．6 Real-Time PCR特异性扩增产物

3．7 膈肌组织skMLCK mRNA的表达

3．8 skMLCK mRNA的表达及膈肌收缩力进行相关性分析

3．9 膈肌CaM mRNA的表达

3．10 CaM mRNA的表达及膈肌收缩力进行相关性分析

3．11 膈肌CaM mRNA与skMLGK mRNA表达的相关性

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 钙调蛋白与骨骼肌兴奋收缩耦联研究新进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历