病毒限制性因子SAMHD1参与DNA损伤修复反应的机制研究

摘要

目的:DNA是生命个体重要的遗传物质，时刻受到体内外有害因素的威胁引起不同程度的DNA损伤，常见的DNA损伤类型包含碱基缺失、碱基对错配、DNA单链断裂(SSB)和DNA双链断裂(DSB)。生物个体在进化过程中为了应对DNA损伤形成了一套复杂而高效的DNA损伤修复(DNA Damage Response，DDR)机制[1]，通过细胞周期阻滞，为修复损伤的DNA赢得充足的时间，保证了遗传信息的正确传递，进而维持基因组的稳定;而DNA损伤严重超出自身修复能力时，细胞将启动自噬、衰老等程序，甚至诱导细胞凋亡，从而限制基因组的不稳定[4]。在人类的多种疾病中已证实存在DDR缺陷，如神经退行性疾病、免疫缺陷、代谢综合征以及癌症等[2-4]。综上，DNA损伤和修复的复杂机制决定细胞的最终命运。
　　细胞周期检验点激酶2（Cell cycle checkpoint kinase2，Chk2）是DNA损伤修复应答反应的关键分子，未发生DNA损伤时，Chk2以非活性的单体形式存在于细胞核中[5];细胞受到基因毒性作用发生DNA损伤时，Chk2被ATM、DNA-PKcs等激活，磷酸化Cdc25C、P53和BRCA1等关键的作用底物，进而调控细胞周期阻滞、DNA修复和细胞凋亡[6]等生物学事件。除了参与DNA损伤修复反应，Chk2在有丝分裂进程和染色体稳定性的维持中起着重要作用。
　　SAMHD1（Sterile alpha motif and HD-domain containing protein1）最初发现于人树突状细胞的cDNA文库，包含SAM结构域和HD结构域。SAM结构域具有蛋白与蛋白或蛋白与核酸之间的相互作用，调节转录和参与信号转导等功能;HD结构域是由组氨酸和天冬氨酸组成，主要发挥磷酸水解酶的活性。SAMHD1作为哺乳动物体内的三磷酸水解酶(dNTPase)，可以将细胞内的dNTP水解为核苷酸和三磷酸，该水解酶活性受其蛋白质磷酸化修饰水平的调控，SAMHD1蛋白磷酸化水平越高，其dNTP水解酶活性越低。以往研究显示，细胞周期蛋白(Cyclin A2)及细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1)可以在苏氨酸(Thr)592位点磷酸化SAMHD1，从而降低其dNTP水解酶活性，引起细胞内dNTP含量升高，有利于病毒复制[7-9]。在巨噬细胞、树突状细胞及静息期的CD4+T细胞（G0/G1期）中，SAMHD1显著降低细胞内的dNTP水平，使人免疫缺陷病毒(HIV-1)的复制及感染受限，因而被看做是抗逆转录病毒的天然免疫蛋白[10,11]。研究发现，SAMHD1突变与人类自身免疫疾病AGS综合征（Aicardi-Goutieres syndrome）密切相关[12,13]，在患者的成纤维细胞中已检测到dNTP水平增加与慢性DNA损伤[14]，研究报道腺病毒、单纯疱疹病毒感染机体过程中伴随DNA损伤[15]，揭示了病毒感染与宿主细胞DNA损伤和修复途径之间存在复杂的关系，提示我们SAMHD1可能参与DNA损伤修复反应。
　　目前已报道SAMHD1作为一种新型的病毒抑制因子，能强有力的对抗HIV-1等逆转录病毒感染;关于SAMHD1限制HSV-1等DNA病毒感染的研究较少;在病毒感染与复制的不同阶段，SAMHD1调节宿主细胞内DNA损伤与修复反应的具体机制尚不清楚。因而，本研究旨在探讨天然免疫蛋白SAMHD1是否参与DNA损伤修复过程;解析SAMHD1参与调控DNA损伤修复反应的分子机制;阐明SAMHD1作为DNA损伤修复反应经典通路中Chk2的底物，其磷酸化修饰水平对维系基因组稳定性的影响。
　　方法:1.利用Ⅰ型人疱疹病毒(HSV-1)感染人结直肠癌细胞(HCT116)实验，研究SAMHD1对DNA病毒感染的限制作用。2.培养人结直肠癌(HCT116)细胞和小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞，通过Western Blot技术检测应激条件下DNA损伤修复反应标志性蛋白表达及SAMHD1蛋白磷酸化水平变化。3.通过慢病毒包装建立稳定沉默SAMHD1的细胞株、过表达SAMHD1的细胞株，检测正常培养及应激条件下DNA损伤修复反应标志性蛋白的改变，观察SAMHD1表达水平对DNA损伤修复过程的影响。4.运用免疫共沉淀方法，检测正常培养及应激条件下Chk2与SAMHD1的结合情况和SAMHD1磷酸化水平的改变，进一步了解内源性Chk2与SAMHD1的相互作用。5.利用核浆分离实验和激光共聚焦技术检测SAMHD1细胞定位并观察SAMHD1与Chk2在细胞中分布情况。6.在沉默Chk2与过表达Chk2的人结直肠癌细胞、缺失Chk2与正常对照的乳腺癌细胞中，检测正常培养及应激刺激下DNA损伤修复反应标志性蛋白的改变。探究Chk2调控SAMHD1磷酸化水平对DNA损伤修复反应的影响。
　　结果:1.在HSV-1感染过程中，SAMHD1发挥了抗病毒感染的功能。2.SAMHD1参与了细胞在应激条件下诱导的DNA损伤修复应答反应的发生，并且伴随SAMHD1磷酸化水平的升高。3.在DNA损伤刺激条件下，沉默SAMHD1抑制了细胞内dNTP水解功能，有利于DNA复制，促进了DNA损伤修复反应。4.Chk2在应激条件下与SAMHD1在细胞内结合，这种结合作用随刺激时间逐渐增强并伴随SAMHD1磷酸化水平增加。5.SAMHD1主要分布在细胞核内，并且在应激刺激下与Chk2共定位于细胞核。6.Chk2在DNA损伤刺激条件下通过调控SAMHD1的磷酸化水平促进了DNA损伤修复反应的发生。
　　结论:本研究扩展了SAMHD1的抗病毒功能;首次提出天然免疫蛋白SAMHD1参与DNA损伤修复反应;揭示Chk2磷酸化修饰SAMHD1调控DNA损伤修复反应及对维系基因组的稳定性的影响。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 材料与试剂

2．1．1 常规生物试剂

2．1．2 常用抗体

2．1．3 细胞、病毒以及RNAi

2．1．4 细胞实验相关试剂

2．1．5 常用试剂的配制

2．1．6 主要相关仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 RNA提取及逆转录方法

2．2．3 细胞转染

2．2．4 蛋白印迹

2．2．5 免疫共沉淀

2．2．6 核浆蛋白分离

2．2．7 免疫荧光

2．2．8 分子克隆与SAMHD1质粒的构建

2．2．9 HSV-1感染实验

3 实验结果

3．2 在应激条件下，SAMHD1参与DNA损伤修复反应

3．3 细胞周期检验点激酶Chk2可以与SAMHD1相互结合

3．4 Chk2磷酸化修饰SAMHD1促进了DNA损伤修复反应

4 讨论

5 结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述 SAMHD1蛋白生物学功能最新研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介