长链非编码RNA H19介导缺血性脑卒中的临床意义及分子机制研究

摘要

目的：缺血性脑卒中为一类脑血液循环障碍性疾病，以起病急骤、进展迅速的局限性或弥漫大面积神经功能缺损为临床特点，目前已成为全球影响伤残调整寿命年的第三大病因。上世纪七十年代起，人们开始了基于缺血性脑卒中相关生物化学信号通路的缺血性脑卒中神经保护措施研究，从九十年代起，研究者们开始试验通过药物对这些信号通路相关蛋白进行干预从而治愈缺血性脑卒中。目前临床上唯一认可的缺血性脑卒中的有效治疗手段仅有溶栓治疗，然而对于很多缺血性脑卒中患者溶栓治疗效果并不理想而且副作用显著。缺血性脑卒中难治性的原因在于其为一种环境与基因相互作用引起的多因素多机制疾病，因而缺血性脑卒中治疗的根本措施在于从基因层面上挖掘与缺血性脑卒中的发病及遗传易感性密切相关的基因，并在分子水平上验证该基因的转录或翻译产物与缺血性脑卒中发病之间的关系并探索其参与缺血性脑卒中发病的具体机制，最终通过生化手段对其进行靶向干预。H19基因为母系等位基因表达的父系印迹基因，长度为2.7kb，位于11号染色体短臂第1区第5带第5亚带，H19基因的作用尚不明确。研究已证实H19基因多态性与冠心病、肥胖以及高血压等的发生发展密切相关。由于冠心病、肥胖、高血压都为缺血性脑卒中的危险因素，因而H19的基因多态性可能与缺血性脑卒中有关。H19基因可在RNA聚合酶Ⅱ的催化作用下转录为不能被翻译为蛋白质的长链非编码RNA H19。动脉粥样硬化为缺血性脑卒中的病因之一，血管内动脉粥样硬化斑块的产生可以促进血栓形成，直接导致缺血性脑卒中的发生。研究已证实，在人动脉粥样硬化斑块中长链非编码RNA H19的表达上调。脑缺血导致的最直接的病理改变就是脑组织缺氧，在肝癌及膀胱癌细胞系中已经证实，缺氧可以通过激活缺氧诱导因子1α(HIF-1α)明显增加长链非编码RNAH19的表达。由此，我们推测H19基因多态性可能与缺血性脑卒中的发病有关且长链非编码RNA H19的表达很可能参与缺血性脑卒中的发生发展过程。长链非编码RNA H19可参与调节凋亡过程，凋亡与自噬密切相关，且神经元的凋亡及自噬都参与缺血性脑卒中的发病。此外长链非编码RNA H19可调节组蛋白去乙酰化酶的活性，而缺血条件下组蛋白去乙酰化酶活性的改变可参与调节小胶质细胞的极化状态导致免疫反应的发生，进而导致并加剧脑损伤。因而长链非编码RNA H19可能通过调节神经元的凋亡、自噬过程及小胶质细胞的极性转化参与缺血性脑卒中的发病。
　　方法：收集缺血性脑卒中患者血液标本检测H19基因多态性，判断其与缺血性脑卒中发病率的关系，并应用实时定量PCR方法检测血浆、中性粒细胞及淋巴细胞中长链非编码RNAH19的表达情况并判定其与患者神经功能损伤的严重程度及其他临床指标的关系。在此基础上在小鼠大脑中动脉栓塞模型中采用侧脑室注射H19小干扰RNA的方法抑制长链非编码RNAH19的表达，判断其是否参与缺血性脑卒中的发病过程。此后，本研究采用神经元及小胶质细胞的氧糖剥夺模型检测长链非编码RNAH19的表达情况，使用小干扰RNA抑制长链非编码RNA H19及其他相关蛋白的表达，质粒转染增加相关蛋白的表达，并应用Western blot和免疫荧光的方法判断神经元自噬及小胶质细胞表型转化相关蛋白的表达情况，判断长链非编码RNA H19是否通过调节神经元自噬及小胶质细胞免疫炎性反应参与缺血性脑卒中的病理过程及其通过怎样的机制调控以上生物过程。
　　结果：⑴H19基因单核苷酸多态性位点突变可影响患者缺血性脑卒中的发病率，缺血性脑卒中患者血浆、中性粒细胞、淋巴细胞中长链非编码RNA H19的表达均上调，且缺血性脑卒中患者长链非编码RNA H19的表达水平与其神经功能缺损严重程度及血浆炎症因子血浆TNF-α的水平正相关。⑵大脑中动脉栓塞模型小鼠血浆、白细胞及脑组织中长链非编码RNA H19的表达均上调，在此基础上采用侧脑室注射H19小干扰RNA的方法抑制长链非编码RNA H19的表达，长链非编码RNA H19表达抑制组的小鼠与单纯缺血组相比脑梗死体积及脑水肿体积均显著减小(P＜0.05)，且长链非编码RNAH19表达水平与血浆TNF-α水平呈正相关，说明长链非编码RNA H19参与缺血性脑卒中脑梗死、脑水肿形成及炎症反应。⑶在神经元氧糖剥夺模型中抑制长链非编码RNA H19的表达，与单纯氧糖剥夺组细胞相比，神经元细胞凋亡率及自噬相关蛋白表达水平减低，且在抑制长链非编码RNAH19的同时抑制DUSP5蛋白的表达可逆转长链非编码RNAH19抑制所发挥的保护作用。⑷在小胶质细胞氧糖剥夺模型中抑制长链非编码RNA H19的表达，与单纯氧糖剥夺组细胞相比，小胶质细胞组蛋白H3、H4的乙酰化增加且其向M1表型的转化减少，而在抑制长链非编码RNA H19的同时增加HDAC1的表达可抵消长链非编码RNA H19抑制对于小胶质细胞的保护作用。
　　结论：①H19基因多态性与缺血性脑卒中患者的发病率密切相关，缺血性脑卒中患者血液中长链非编码RNAH19表达增加,且长链非编码RNAH19可用于缺血性脑卒中的诊断、严重程度推测并与免疫反应密切相关。②长链非编码RNA H19参与缺血性脑卒中小鼠脑梗死、脑水肿形成及免疫反应的发生。③长链非编码RNA H19通过抑制DUSP5-ERK1/2轴调节缺血性脑卒中过程中神经元自噬的激活。④长链非编码RNAH19通过上调HDAC1蛋白抑制组蛋白的乙酰化促进缺血性脑卒中过程中小胶质细胞向M1表型转化。

目录

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摘要

英文缩略语

第一部分：缺血性脑卒中患者H19基因多态性、循环血lncRNA H19表达水平及意义

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要试剂、材料和仪器

2．2 研究对象与分组

2．3 实验方法

2．4 数据分析

3 实验结果

3．1 H19基因多态性与缺血性脑卒中发病率的关系

3．2 缺血性脑卒中患者血浆、中性粒细胞及淋巴细胞中长链非编码RNA H19的表达及意义

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分：lncRNA H19对缺血性脑卒中过程中神经元凋亡及自吞噬的影响及分子机制研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 研究对象及分组

2．3 实验方法

2．4 数据分析

3 结果

3．1 氧糖剥夺处理对于SH-SY5Y细胞系lncRNA H19表达水平的影响

3．2 lncRNA H19的抑制对于神经元OGD／R损伤诱导的凋亡过程的影响

3．3 lncRNA H19的抑制对于神经元OGD／R损伤诱导的自噬过程的影响

3．4 OGD／R条件下神经元lncRNA H19的上调通过激活自噬过程减低细胞活力

3．5 LncRNA H19通过抑制DUSP5-ERK1／2轴诱导自噬激活

4 讨论

5 结论

参考文献

第三部分：lncRNA H19对缺血性脑卒中过程中小胶质细胞的激活及极化的影响及分子机制研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 研究对象及分组

2．3 实验方法

2．4 数据分析

3 结果

3．1 lncRNA H19的抑制对于OGD／R导致的小胶质细胞细胞活力下降及其M1表型转化的影响

3．2 lncRNA H19的抑制对于OGD／R条件下小胶质细胞增殖的影响

3．3 lncRNA H19的抑制对于OGD／R诱导的HDAC蛋白的上调及组蛋白H3、H4乙酰化的影响

3．4 OGD／R条件下lncRNA H19的抑制通过下调HDACl的表达促进小胶质细胞由M1表型向M2表型转化

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 非编码RNA在脑血管病诱导免疫反应中的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历