新型离子通道Piezo1对压力介导的大鼠视乳头星形胶质细胞活化迁移的调控研究

摘要

目的:青光眼(glaucoma)是一种慢性视神经退行性损伤疾病，以视神经纤维丢失和视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡为基本病理过程。大量的研究结果表明高眼压(IOP)是青光眼最明确、最主要的危险因素，眼部的视乳头筛板区域是青光眼的初始损伤部位。
　　视乳头筛板区域的星形胶质细胞能够敏感地早期感受和响应来自眼压波动导致的机械刺激，发生活化，活化出现的星形胶质细胞形态位点和细胞因子及细胞外基质成分分泌功能改变，导致视神经轴突生存微环境改变;但活化与青光眼损伤之间的具体联系机制尚不明确，推论由于星形胶质细胞(AS)是该区域占绝对优势的细胞，而AS的压力敏感特性在高眼压与轴突变性之间也构成了一种联系，因此压力介导的AS活化可能在青光眼发病过程中具有重要意义。
　　活化发生的具体机制尚不明确，Piezo1是一种新发现的机械敏感离子通道，具有机械敏感性，可被机械力直接激活。本研究通过自主研发的体外加压体系处理大鼠视乳头星形胶质细胞(ONHAs)，观察压力梯度下AS活化情况，并通过特异性抑制探究Piezo1通道对活化过程中炎性反应和迁移的调控作用。
　　方法:①原代提取大鼠ONHAs，给予0，20，40，60mmHg压力分别作用10小时，24小时，免疫荧光方法对ONHAs进行鉴定以及观察Piezo1、GFAP蛋白的表达情况，ELISA法检测大鼠视乳头星形胶质细胞上清液中TNFα的水平，Western blot法检测大鼠视乳头星形胶质细胞Piezo1蛋白、GFAP的表达，实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)检测大鼠视乳头星形胶质细胞中Piezo1mRNA的表达，Transwell法测定大鼠视乳头星形胶质细胞迁移情况;②特异性抑制剂GsMTx4，ALLN以及瞬时转染技术处理细胞，免疫荧光法测定Ca2+，Calpain Assay Kit法检测Calpain的活性，ELISA法检测细胞上清液中TNFα的水平，Western blot法检测整合素β1，GFAP的表达，Transwell方法测定细胞迁移情况。
　　结果:①梯度压力(0，20，40，60mmHg)分别作用于大鼠视乳头星形胶质细胞10h，24h，与对照组相比，随着压力的增加，星形胶质细胞标志蛋白GFAP的表达明显上调，细胞迁移数增多，TNFα的含量增加，表明星形胶质细胞活化，同时Piezo1蛋白的表达也增多，Piezo1蛋白变化与细胞迁移数，TNFα的水平呈同步趋势。60mmHg作用下，培养24h与10h相比，上述指标表达更为明显。②60mmHg作用下，使用Piezo1特异性抑制剂GsMTx4，与无抑制剂组相比，GFAP表达没有变化，但星形胶质细胞迁移数减少，TNFα分泌量明显减少，整合素β1表达降低;同时细胞内Ca2+表达降低，Calpain的活性降低。在使用Calpain特异性抑制剂ALLN时，两组相比ONHAs迁移数和TNFα分泌量也明显降低，GFAP表达仍然没有变化，整合素β1表达降低。③60mmHg下，运用外源性整合素β1shRNA片段Itgb1-RNAi(4980-1)瞬时转染细胞，抑制整合素β1表达，与阴性转染组比，ONHAs迁移数减少，GFAP表达没有变化。
　　结论:研究结果提示，Piezo1离子通道参与了单纯压力作用下的星形胶质细胞活化的调控，通过促进细胞内钙离子内流，上调calpain活性，最终促进炎性因子释放和细胞迁移;而Piezo1及calpain途径调节星形胶质细胞迁移的作用通过了上调整合素β1环节。另外，Piezo1，calpain，整合素β1不影响压力下星形胶质细胞活化的GFAP生成途径。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：梯度压力下大鼠视乳头星形胶质细胞活化情况

1 前言

2．1 主要试剂与仪器

2．2 研究对象和分组

2．3 实验方法

2．4 统计学方法

3 结果

3．1 原代提取的大鼠视乳头星形胶质细胞鉴定

3．2 免疫荧光检测压力梯度作用后GFAP的表达

3．3 WesternBlot法测定压力梯度作用后GFAP的表达

3．4 Transwell法检测压力梯度作用后ONHAs的迁移

3．5 ELISA法检测压力梯度作用后ONHAs的TNFα分泌

4 讨论

5 结论

第二部分 梯度压力下Piezo1在大鼠视乳头星形胶质细胞中的表达及其对活化的影响

6 前言

7．1 主要试剂与仪器

7．2 研究对象和分组

7．3 实验方法

7．4 统计学方法

8 结果

8．2 Real-TimePCR法检测压力梯度作用后ONHAs中Piezo1的mRNA表达

8．3 WesternBlot法检测压力梯度作用后ONHAs中Piezo1蛋白表达

8．4 TransWell法检测GsMTx4处理后ONHAs的迁移

8．5 ELISA法检测GsMTx4处理后ONHAs的TNFα分泌

8．6 免疫荧光法检测GsMTx4处理后ONHAs中Ca2+表达

8．7 酶标法检测GsMTx4处理后ONHAs中Calpain活性

9 讨论

10 结论

第三部分 压力下Piezo1通过Calpain调节大鼠视乳头星形胶质细胞活化的实验研究

11 前言

12．1 主要试剂与仪器

12．2 研究对象和分组

12．3 实验方法

13 结果

13．1 Transwell法检测ALLN处理后ONHAs的迁移

13．2 ELISA法检测ALLN处理后ONHAs的TNFα分泌

13．4 WesternBlot法检测ALLN处理后整合素β1在ONHAs中的表达

13．5 Real-Time PCR和WB法检测瞬时转染整合素β1在ONHAs中的转染效率

13．6 Transwell法检测转染了Itgb1-RNAi(4980-1)后ONHAs的迁移

13．7 WB法检测分别加入抑制剂GsMTx4，ALLN，转染了Itgb1-RNAi(4980-1)后ONHAs中GFAP的表达变化

14 讨论

15 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在校期间科研成绩

致谢

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