金属纯钛表面梯度纳米结构化及其对人羊膜间充质干细胞黏附、增殖与分化的影响

摘要

目的:在医用金属纯钛表面进行梯度纳米结构化，评价梯度纳米纯钛材料对人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)黏附、增殖和分化的影响，为新型种植材料的开发提供实验依据。
　　研究方法:
　　1.材料制备:采用表面机械研磨处理(SMAT)技术，在医用金属纯钛板材料表面进行梯度纳米结构化，并获得表面晶粒尺寸为纳米级的金属纯钛材料。SMAT处理后再经退火处理，使晶粒长大，获得表面粗糙度相同的粗晶金属纯钛材料。
　　2.采用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和表面粗糙度仪对实验材料进行表征。计算其表面晶粒尺寸范围，确定表面晶粒的平均尺寸和表面粗糙度。
　　3.经中国医科大学附属第一医院伦理委员会同意和患者知情同意，在无菌操作下提取人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)，利用流式细胞术对hAMSCs表面的CD29、CD44、CD73进行鉴定。采用碱性磷酸酶(ALP)染色法和茜素红染色法对hAMSCs成骨向分化行为进行观察。
　　4.采用Cell Counting Kits-8(CCK-8)法检测hAMSCs的增殖情况并绘制hAMSCs的增殖曲线。
　　5.分组:实验组为纳米级金属纯钛材料(nano-Ti)，对照组为粗晶金属纯钛材料(coarse-Ti)。分别在各组材料表面进行hAMSCs的接种与培养。
　　6.采用扫描电子显微镜(SEM)观察hAMSCs在各组材料表面的黏附及生长状况。
　　7.利用免疫荧光对肌动蛋白（细胞骨架）、纽蛋白（黏着蛋白）和细胞核进行染色观察细胞形态。
　　8.采用MTS法和流式细胞仪(FCM)检测法分析hAMSCs在各组材料表面的增殖情况。
　　9.采用碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)蛋白表达水平上的含量测定技术分析各组材料对hAMSCs成骨向分化的影响。
　　结果:1.TEM结果:通过SMAT方法可以对金属钛板表面进行纳米结构化并获得梯度纳米结构，其表面晶粒尺寸多分布在10-100nm范围内，平均晶粒尺寸约为56nm。
　　2.hAMSCs的培养与鉴定:光学显微镜下见hAMSCs原代培养3d后，大部分细胞为梭形或多角形，培养6d后细胞融合度达80％以上，呈放射状或漩涡状排列。hAMSCS经成骨诱导14d后，ALP染色见细胞胞质呈棕黑色;成骨诱导21d后，茜素红染色见细胞之间有明显深染的红色钙结节形成，这些说明hAMSCs经成骨诱导培养液定向诱导后可以分化为成骨细胞。利用流式细胞仪对hAMSCs的表面抗原CD29、CD44、CD73进行检测，阳性率都为90％以上。
　　3.CCK-8法绘制hAMSCs的增殖曲线:hAMSCs传代培养后的潜伏期为2天，对数增殖期为第3到第6天，随后进入平台期。
　　4.SEM观察结果:hAMSCs接种在各组材料表面2d后，在纳米金属纯钛上的细胞伸展较粗晶纯钛上的好，可见大量的丝状伪足。说明与粗晶纯钛相比，纳米金属纯钛材料具有良好的促进hAMSCs伸展和黏附的能力。
　　5.免疫荧光染色结果:hAMSCs接种在各组材料表面2天后，与粗晶纯钛相比，纳米纯钛上的细胞伸展良好，在细胞边缘可见大量的纽蛋白形成。说明纳米金属纯钛材料具有良好的促进hAMSCs黏附的能力
　　6.MTS检测结果:随着培养时间的延长，各组材料上hAMSCs的MTS值均而逐渐升高。且在各个时间点，纳米组MTS值均高于粗晶组。在培养的第3d、5d和7d时，各组间的差异具有统计学意义。这说明纳米金属纯钛材料比粗晶金属纯钛材料具有更好的促进hAMSCs增殖的能力。
　　7.FCM检测结果:培养5d时，纳米组细胞的增殖指数(PI)高于粗晶组，其差异具有统计学意义。这说明纳米金属纯钛材料相对于粗晶金属纯钛材料具有更好的促进hAMSCs增殖的能力。
　　8.ALP活性检测结果:随时间的增加，各组材料上细胞的ALP活性均逐渐升高。在各个时间点，纳米组ALP活性高于粗晶组。在第3d、7d、14d纳米组与粗晶组的差异具有统计学意义，这说明纳米金属纯钛材料相对于粗晶金属纯钛材料具有更好的促进早期hAMSCs成骨向分化的能力。
　　9.OCN蛋白表达水平上的含量检测结果:随着时间的延长，各组材料上细胞的OCN蛋白表达水平上的含量均而逐渐升高。在各个时间点，纳米组的OCN蛋白表达水平上的含量均高于粗晶组，且在培养10d和14d时，其差异具有统计学意义。这说明梯度纳米金属纯钛材料相对于粗晶金属纯钛材料具有更好的促进hAMSCs成骨向分化的能力。
　　结论:1.采用SMAT方法可以获得梯度纳米金属纯钛材料，其表面晶粒范围为10-100nm，平均晶粒尺寸为56nm。
　　2.梯度纳米金属纯钛材料相对于粗晶金属纯钛材料具有更好的促进hAMSCs黏附、增殖与分化的能力。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料与方法

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 实验材料

2．2．4 hAMSCs的鉴定

2．2．5 CCK-8法测定细胞增殖曲线

2．2．6 SEM电镜观察

2．2．7 荧光染色观察

2．2．8 细胞增殖检测

2．2．9 FCM检测细胞周期并计算PI值

2．2．10 ALP活性检测

2．2．11 OCN蛋白表达水平上的含量检测

2．2．12 统计学分析

3．1 表面粗糙度检测

3．2 SEB检测

3．3 TEB检测

3．4 hAMSCs原代培养及鉴定

3．5 HAMSCs的增殖曲线

3．8 MTS检测

3．9 FCM检测

3．10 ALP活性检测

3．11 OCN蛋白表达水平上的含量检测

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 纳米金属材料及其在医学中的应用

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历