创伤后应激障碍大鼠杏仁核细胞周期因子表达变化的研究

摘要

目的:
　　创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)是最为典型的一种应激性疾病，是由经历严重的心理创伤事件而导致出现的精神障碍并持续存在[1]。PTSD的主要临床表现为:创伤事件的重复出现，记忆出现异常;持续性对回忆逃避并反应麻木;情绪的易激惹及警觉性增高。目前PTSD的发病机制尚未完全搞清，所以尚缺乏有效的治疗手段，特别是缺乏直接针对病因靶点的药物，临床上以给予患者对症、心理治疗为主，治疗效果往往不明确。因此，对PTSD发病机制的研究成为了目前该领域研究的热点。
　　边缘系统作为主管人体情绪行为反应的重要结构，其作用与应激反应密不可分。杏仁核作为边缘系统中极其重要的组成部分，被认为是恐惧形成和表达的关键中枢，与PTSD的发病关系密切[2，3]。有研究表明[4]，杏仁核在PTSD中表现为高度敏感，并且它的激活程度和PTSD的症状严重程度以及表现的焦虑感是呈正比的。有研究证实[5]，杏仁核神经细胞在PTSD发病过程中存在数量及结构的改变。动物实验研究发现在单一连续刺激(single-prolonged stress，SPS)建立的PTSD大鼠模型的杏仁核脑区出现了神经细胞结构及功能的改变，并且凋亡加速[6，7]。但是，对于其潜在机制还不十分明确，因此探索PTSD引起杏仁核神经细胞结构及功能改变的机制对于研究PTSD的发病机制及其临床治疗起到关键的作用。
　　细胞周期是指真核细胞通过有丝分裂进行细胞增殖的循环过程，分为4期:DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期）。影响细胞周期进程的主要调节因子有细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶(CDKs)和细胞周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂(CDKIs)，其中Cyclins是调节分子，而CDKs是催化亚基[8]。
　　成熟的神经细胞是神经上皮干细胞经细胞分化后形成的终末细胞，已丧失分裂增殖能力。然而，大量研究证据显示[9，10]，在中枢神经系统受到损伤时，神经细胞保留了细胞周期再次被激活的能力，引起了细胞周期相关因子CyclinD1和CDK4的上调，从而启动神经细胞再次进入细胞周期。但是神经细胞这种重新启动的细胞周期过程是紊乱的，这种紊乱的细胞周期进程不能调控细胞完成完整的分裂增殖，而是使细胞停滞在细胞周期的某个时期，从而引发细胞的凋亡或退变[11，12]。
　　细胞周期影响神经细胞凋亡过程的分子机制目前还不十分清楚。一些相关的细胞周期路径已被证实与中枢神经系统疾病中神经细胞凋亡过程有关。综上，我们推测PTSD条件下，细胞周期可能参与了杏仁核神经细胞的凋亡过程，引起杏仁核神经细胞结构和功能的改变[13]。
　　本研究将细胞周期调控作为研究的一个切入点，通过观察PTSD大鼠杏仁核细胞周期因子CyclinD1和CDK4基因表达变化，检测pRB、E2F1蛋白及RBmRNA、E2FlmRNA的表达水平，进而探讨了PTSD杏仁核神经细胞的细胞周期相关因子的表达变化以及CDK4-pRB-E2F1信号转导通路的改变，为深入揭示PTSD发病机制及有效预防、治疗PTSD提供了可靠的理论及实验依据。
　　方法:
　　本研究采用目前国际上已认定的单一连续刺激(single—Prolonged Stress，SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型，随机分为5组，即对照组、SPS刺激后1d、4d、7d和14d组;应用旷场(open-field，OF)实验及恐惧记忆实验进行行为学测定;应用透射电子显微镜技术观察PTSD大鼠杏仁核神经细胞形态学变化;应用免疫荧光技术检测PTSD大鼠杏仁核神经细胞细胞核及细胞周期相关因子CDK4表达的变化;应用免疫印迹技术检测PTSD大鼠杏仁核神经细胞细胞周期相关因子CyclinD1、CDK4、pRB及E2F1蛋白含量的变化;应用Real Time PCR方法检测CyclinD1mRNA、CDK4mRNA、RB mRNA和E2F1mRNA的表达变化。
　　结果:
　　1、PTSD大鼠一般情况的变化:SPS刺激后，PTSD大鼠出现饮食减少，精神萎靡，活动减少，体重下降等现象，同时SPS刺激后大鼠还出现易激惹、好厮打等行为表现。
　　2、PTSD大鼠行为学改变:旷场实验结果显示，SPS刺激后大鼠进入中心区域的次数显著低于对照组。同时，SPS刺激后大鼠僵立行为百分比明显高于对照组。
　　3、PTSD大鼠杏仁核神经细胞形态发生改变:透射电境下见SPS刺激后，杏仁核神经细胞体积缩小，细胞核染色质浓缩聚集位于核周边。随着SPS刺激时间的递增，可以观察到细胞核膜出现破坏，尤以SPS7d明显。
　　4、PTSD大鼠杏仁核神经细胞细胞核的变化:采用DAPI荧光标记杏仁核神经细胞细胞核，呈蓝色荧光，经过SPS刺激后，细胞核染色质浓缩和核固缩引起细胞核变小和染色增强，强度于SPS7d达高峰。
　　5、PTSD大鼠杏仁核神经细胞细胞周期因子CyclinD1、CDK4的表达变化:(1)Western blotting检测SPS组大鼠杏仁核神经细胞CyclinD1、CDK4蛋白表达明显升高并呈逐渐增强趋势，于7d达到高峰，明显高于对照组。(2)Real Time PCR检测SPS刺激后大鼠杏仁核神经细胞CyclinD1mRNA、CDK4mRNA的表达较对照组增多，并随着刺激后时间的延长呈递增趋势，于7d达到高峰，14d仍维持在较高水平。(3)采用Cy3荧光标记杏仁核神经细胞CDK4，CDK4阳性细胞呈红色荧光。SPS刺激后，CDK4阳性表达逐渐增强。在SPS7d、14d组CDK4表达强度明显高于对照组，并于SPS7d达到了高峰。
　　6、PTSD大鼠杏仁核神经细胞RB、pRB、E2F1的表达变化:(1)Western blotting检测SPS刺激后大鼠杏仁核神经细胞pRB、E2F1蛋白表达与对照组相比逐渐升高，于7d时达到高峰，14d时仍维持较高状态。(2)Real Time PCR检测SPS组大鼠杏仁核神经细胞RBmRNA、E2F1mRNA的表达随刺激后时间呈现上升趋势，明显高于对照组。
　　结论:
　　1、PTSD-SPS大鼠杏仁核神经细胞出现结构及功能的改变。
　　2、细胞周期因子CyclinD1和CDK4在PTSD大鼠杏仁核神经细胞的表达变化，可能参与了SPS引起的了杏仁核结构及功能的改变。
　　3、CDK4-pRB-E2F1信号转导通路表达变化，可能参与了SPS引起的杏仁核结构及功能的改变。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：创伤后应激障碍大鼠行为学改变及杏仁核神经细胞结构变化的研究

1 前言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 PTSD大鼠一般情况变化

3．2 PTSD大鼠行为学改变

3．3 透射电子显微镜观察杏仁核神经细胞形态学变化

3．4 PTSD大鼠杏仁核神经细胞细胞核的变化

4 讨论

5 结论

第二部分：细胞周期因子CyclinD1和CDK4在PTSD大鼠杏仁核神经细胞表达变化的研究

1 前言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．2 Real Time PCR方法检测CyclinD1mRNA和CDK4mRNA表达

3．3 免疫荧光技术检测CDK4表达

4 讨论

5 结论

第三部分：CDK4-pRB-E2F1通路在PTSD大鼠杏仁核神经细胞凋亡中的作用的研究

1 前言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 Western blotting检测pRB和E2F1蛋白表达

3．2 Real Time PCR检测RB mRNA和E2F1mRNA的表达变化

4 讨论

5 结论

本研究创新的自我评价

参考文献

综述 PTSD与杏仁核相关性的研究进展及神经细胞凋亡与细胞周期关系的研究现状

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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