反义导向分子A调控树突状细胞功能并参与实验性自身免疫性脑脊髓炎发病机制的研究

摘要

目的：树突状细胞(dendritic cells，DCs)具有独特的刺激T细胞活化的能力，是连接非特异性和特异性免疫的桥梁。多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统自身免疫性疾病，实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS的经典模型。DCs作为功能最强的抗原递呈细胞，在MS及EAE发病过程中起着枢纽的作用。反义导向分子A(repulsive guidance molecule a，RGMa)作为一种膜蛋白，以往多认为其限制性表达于中枢神经系统，最新研究表明其也在免疫系统发挥作用，然而其对DCs及EAE干预功能未知。因此本研究体外诱导EAE模型，给予RGMa特异性阻断抗体干预，观察RGMa是否参与EAE模型的发生发展，及其是否可在体内调控DCs免疫功能。体外细胞实验中，DCs应用RGMa特异性阻断抗体干预，并体外给予牛膝多糖(Achyranthesbidentata polysaccharide，ABP)或脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激，观察RGMa是否在体外调控DCs功能。本实验为探究RGMa在免疫系统的作用提供线索，为免疫性疾病的治疗提供新的方向。
　　方法：动物实验中，分为3组，分别为:空白组，给予Control IgG抗体干预EAE小鼠(Control IgG/EAE组)，给予RGMa特异性阻断抗体干预EAE小鼠（Anti-RGMa/EAE组）。体外构建EAE小鼠模型，选取合适的RGMa特异性阻断抗体作用剂量，应用侧脑室给药方法给予EAE小鼠干预。实验观察并记录各组动物发病及体重情况，并在发病高峰期，即免疫第22d收集小鼠血液及脑组织进行后续实验。对各组小鼠进行行为学评分，应用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法观察颅内炎性浸润情况，应用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞因子含量，流式细胞术检测颅内DCs表面蛋白的表达量。细胞实验中，分为5组，分别为:RPMI1640组，Control IgG抗体+ABP组(Control IgG/ABP组)，Control IgG抗体+LPS组（Control IgG/LPS组），RGMa特异性阻断抗体+ABP组（Anti-RGMa/ABP组），RGMa特异性阻断抗体+LPS组（Anti-RGMa/LPS组）。提取并纯化C57BL/6小鼠的骨髓源性的DCs，隔天半量换液，收集第5天的DCs进行实验，向每孔添加最佳浓度的RGMa特异性阻断抗体或Control IgG抗体干预，24h后，在不更换培养液的基础上，再向每孔添加ABP（10μg/ml）或LPS(20μg/ml)刺激，再培养24h后，收集细胞或上清备用。然后应用流式细胞术检测细胞凋亡，扫描电镜、透射电镜观察细胞形态，ELISA检测细胞因子分泌，流式细胞术检测细胞吞噬能力及表面蛋白表达。然后将各组DCs与T淋巴细胞共培养，应用MTS实验检测DCs诱导T细胞增殖能力，ELISA实验检测共培养体系细胞因子分泌情况。
　　结果：⑴在动物实验方面，选取RGMa特异性阻断抗体最佳作用剂量为15μg。⑵在各组小鼠行为学评分方面，与Control IgG/EAE组小鼠相比，从免疫第16天开始，Anti-RGMa/EAE组小鼠评分显著降低（P＜0.05）。⑶在小鼠体重方面，与Control IgG/EAE组小鼠相比，从免疫第10天开始，Anti-RGMa/EAE组小鼠体重降低程度显著下降(P＜0.05)。⑷在HE染色方面，Control IgG/EAE组脑部HE染色可见大量炎性细胞浸润，小血管扩张，血管周围可见“血管套袖”样改变，且一个视野内有多个“血管套袖”样改变，炎性评分为2.75±0.25。Anti-RGMa/EAE组小鼠脑部HE染色也可见炎性细胞浸润，但多散在分布，“血管套袖”样改变较为少见，炎性评分为1.50±0.29，评分显著低于Control IgG/EAE组(P＜0.05)。⑸在小鼠体内细胞因子分泌方面，Anti-RGMa/EAE组小鼠体内IL-2、IL-12及TNF-α含量显著低于Control IgG/EAE组（P＜0.05）。⑹在小鼠颅内DCs表面蛋白表达方面，与Control IgG/EAE组相比，Anti-RGMa/EAE小鼠颅内DCs MHCⅡ，CD86，CD80和CD40的表达量显著降低(P＜0.05)。⑺细胞实验中，选取RGMa特异性阻断抗体最佳作用浓度为10μg/ml。⑻在DCs凋亡方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组并无显著变化(P＞0.05);与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组也无显著变化(P＞0.05)。⑼在细胞形态方面，透射电镜可见，RPMI1640组、Anti-RGMa/ABP组与Anti-RGMa/LPS组DCs胞内可见大量的吞噬小泡及溶酶体，但内质网及线粒体等细胞器含量较少。与此相对的，Control IgG/ABP组与Control IgG/LPS组DCs胞内有较多的内质网、高尔基体及线粒体，然而吞噬小泡及溶酶体较少。扫描电镜观察可见，RPMI1640组、Anti-RGMa/ABP组与Anti-RGMa/LPS组DCs胞体较小，表面突起较少。然而Control IgG/ABP组与Control IgG/LPS组DCs形态多种多样，胞体较大，表面多有树枝样突起，粗细不均。⑽在DCs表面蛋白表达方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组DCs表面MHCⅡ，CD86，CD80和CD40的表达量显著降低(P＜0.05)。与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组DCs表面MHCⅡ，CD86，CD80和CD40的表达量也显著降低(P＜0.05)。⑾在DCs细胞因子分泌方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组DCs IL-12，IL-1β及TNF-α的分泌量显著降低，IL-10的分泌量显著升高(P＜0.05)。与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组DCsIL-12，IL-1β及TNF-α的分泌量显著降低，IL-10的分泌量显著升高(P＜0.05)。⑿在检测DCs吞噬能力方面，与Control IgG/ABP组相比，Anti-RGMa/ABP组DCs吞噬能力显著升高（P＜0.05）。并且，Anti-RGMa/LPS组DCs吞噬能力相比于Control IgG/LPS组，也存在较大程度的提高(P＜0.05)。⒀在诱导T细胞增殖及分化能力方面，当DCs与T细胞共培养比例为1∶1及1∶10时，Anti-RGMa/ABP组DCs诱导T细胞增殖能力相比于Control IgG/ABP组，存在较大程度的降低(P＜0.05)。与Control IgG/LPS组相比，Anti-RGMa/LPS组DCs诱导T细胞增殖能力也显著降低(P＜0.05)。当DCs与T共培养细胞比例为1∶1，相比于Control IgG/ABP组，Anti-RGMa/ABP组共培养体系中IL-2及IFN-γ含量显著降低(P＜0.05)，而IL-10及IL-13含量显著升高(P＜0.05)。类似的情况也存在于Anti-RGMa/LPS组，与Control IgG/LPS组相比较，共培养体系中IL-2及IFN-γ含量显著降低(P＜0.05)，而IL-10及IL-13含量显著升高(P＜0.05)。
　　结论：①RGMa参与小鼠EAE发病，并可在体内调控DCs的免疫功能。②RGMa在体外参与调控DCs的免疫功能，特异性阻断抗体干预后的DCs具有耐受性及免疫调节性。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：反义导向分子A体内调控树突状细胞功能并参与实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 结果

3．1 RGMa特异性阻断抗体最佳作用剂量

3．2 各组小鼠一般情况比较

3．3 各组小鼠颅内炎性细胞浸润情况

3．4 各组小鼠体内细胞因子分泌

3．5 各组小鼠颅内DCs表面蛋白表达

4 讨论

5 结论

第二部分：反义导向分子A体外调控树突状细胞功能的研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 结果

3．1 DCs成熟过程中RGMa表达

3．2 RGMa特异性阻断抗体最佳作用浓度

3．3 各组DCs凋亡检测

3．4 各组DCs细胞形态

3．5 各组DCs表面蛋白表达

3．6 各组DCs细胞因子分泌

3．7 各组DCs吞噬能力

3．8 各组DCs诱导T细胞增殖及分化能力

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 树突状细胞的免疫功能及在多发性硬化免疫治疗的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历