MLO-Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离

摘要

该论文直接目的是分离可被Cbfa1诱导的新基因,长远目标在于找到与骨骼细胞分化相关转录因子.该文以具有早期骨细胞特征MLO-Y4(Murine Long Bone Osteocyte-Y4)细胞为研究对象,将Cbfa1基因转染到细胞内后,用抑制性消减杂交(SSH)方法进行新基因分离,成功构建了Cbfa1诱导下表达基因片段文库.从文库中随机选出的83个阳性克隆中,含有Cbfa1基因片段克隆24个,含有其它已知基因片段克隆19个,含有未知基因片段克隆40个,占克隆总数的67.8﹪.实验用VirtualNorthern blot方法证明了其中一个没有同源序列的未知基因是Cbfa1诱导下表达的新基因.因为,在Cbfa1诱导的已知基因中有Osx存在,所以,实验进一步以RT-PCR法证实在MLO-Y4细胞中Cbfa1可以诱导Osx表达.该实验同时用RT-PCR法在另两种成骨细胞MC3T3-E1、U2OS中也检测到了Cbfa1诱导Osx的表达.

目录

前 言

一文献综述

(一)骨骼的发育及其影响因素

(二)成骨细胞分化相关转录因子的研究及进展

(三)MLO-Y4细胞简介

(四)分离特异表达基因的方法研究以及进展

二本论文的研究目的和意义

材料和方法

一实验材料

1.细胞及其培养试剂

2.细胞转染以及RNA制备试剂

3.Subtraction相关试剂以及药品

4.主要仪器及设备

二实验方法

1.MLO-Y4细胞的培养

2.大肠杆菌感受态细胞的制备

3.感受态细菌的转化及α互补筛选

4.转染质粒制备

5.MLO-Y4细胞的转染

6.RNA的制备及电泳检测

7.RT-PCR

8.PCR-Selected subtraction

9.Virtual Northern blot

实验结果与分析

一检测转染效率的RT-PCR结果

二抑制性消减杂交(SSH)的结果

1.PCR法合成dsDNA结果

2.回收产物经过RsaI酶切后电泳结果

3.两次PCR的结果

4.检测探针制备及Virtual Northern blot结果

5.构建消减文库以及测序结果

6.进一步筛选的结果

7.在MLO-Y4和其它两种成骨细胞中Cbfal对Osx作用

讨 论

一MLO-Y4细胞转染

二SSH成功的必要条件

三测序结果分析

四Cbfal在两种成骨细胞中诱导Osx表达

结 论

参考文献

致 谢

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