鸡卵清蛋白基因调控序列调控人α1抗胰蛋白酶基因在CHO细胞中的表达

摘要

人α1抗胰蛋白酶(α1AT)是哺乳动物血液中一种重要的蛋白酶抑制剂,抑制人体内多种不同的丝氨酸蛋白酶免受弹性蛋白酶的水解.它是一种含有碳水化合物侧链的单链糖蛋白,分子量52KDa,由394个aa组成,α1AT基因全长12.2Kb定位于14q31-32,含有3个非编码外显子,4个编码外显子和6个内含子,α1AT肝细胞中的片段全长1434bp包括49bp5'非编码区,1254bp编码区,一个终止密码子,79bp3'非编码区及一个poly(A)尾.随着对α1AT缺乏者基因缺陷特征的认识及基因序列的克隆,基因治疗已成为一种有前途的治疗措施,近年米对α1AT的重组表达研究进展很快,大致有原核生物细胞水平,真核生物细胞水平及转基因动物三个阶段.该研究采用5'RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置,通过序列分析得出转录起始点为G,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置.应用PCR技术特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列-1340bp~+1655bp片段和第一内含子+49bp~+1655bp片段,长度分别为2.9kb和1.5kb,经PCR测序和克隆测序后,针对突变的碱基进行修复,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP-N2载体上,为使pGFP-N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究,将其切去,构建了P<,2.9koval>-GFP和P<,1.5koval>-GFP两种表达载体,经测序和酶切鉴定这两种表达载体构建正确.采用脂质体转染法分别将上述两种构建载体、pGFP-N2(阳性对照)质粒及阴性对照转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中.用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达.结果表明两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达萤光蛋白基因.结果显示该文构建的卵清蛋白基因的5'调控区和第一内含子对基因的表达起到一定的调控作用.用人α 1抗胰蛋白酶(α1-AT)基因的信号肽编码序列替换鸡卵清蛋白基因的信号肽编码序列,构建了包括鸡卵清蛋白基因启动子和外显子1,内含子1共约2.9Kb片段以及人α1抗胰蛋白酶全长cDNA序列和鸡卵清蛋白基因3'非编码区部分序列的表达载体P<,5'UTR-AT-3'UTR>,融合基因经脂质体转染至中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)中,通过PCR、ELISA和Western杂交鉴定,证明所构建的鸡卵清蛋白基因启动子能有效调控α1-AT基因在CHO细胞中高效表达,并能保持α1-AT的生物活性.为进一步研究转基因鸡输卵管生物反应器高效表达人α1-AT提供了可行性.

目录

前言

1鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

2.鸡卵清蛋白基因第一内含子序列启动GFP基因表达载体的构建

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

3.鸡卵清蛋白基因5’调控序列启动GFP基因表达载体的构建

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

4.P1.5koval-GFP和P2.9koval-GFP两种表达载体在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中的表达

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

5.人α 1抗胰蛋白酶cDNA基因载体构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

5.1材料

5.2方法

5.3结果

5.4讨论

6.综述

6.1α 1抗胰蛋白酶的研究进展

6.2 α 1抗胰蛋白酶基因调控与重组表达研究进展

参考文献

7.结论与创新

7.1主要结论

7.2创新性

附录

致谢

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