虾夷扇贝外套膜cDNA文库构建、EST测序分析及线粒体非编码区多态性研究

摘要

虾夷扇贝(Mizuhopecten(Patinopecten)yessoensis)属软体动物门(Mollusa)，半鳃纲(Lamellibranchia)，翼形亚纲(Pterimorphia)，珍珠贝目(Pterioida)，扇贝科(Pectinidae)，虾夷扇贝属(Mizuhopecten)。20世纪80年代初，辽宁海洋水产科学研究院从日本青森县陆奥湾引入中国，目前成为我国北方沿海重要的养殖品种。
　　 本研究构建了虾夷扇贝外套膜全长cDNA文库。对该文库中随机选取的960个克隆进行5’端测序，获得了923条有效EST序列。通过生物信息学的方法对这些序列进行拼接后得到567条unigene，包含105个序列重叠群(contig)和462条singletons，计算序列的平均长度为774 bp。
　　 利用BLASTX和BLASTN对数据库中的序列进行比对分析，发现存在明显相似性的序列有267条，占总数的47.1％。将所有EST序列按其序列相似性功能进行分类(COG分类)后，157条unigene获得了基因注释，约占序列总数的27.7％。在已知的功能序列中，发现部分与机体防御相关的基因，如大防御素、G型溶菌酶、热休克蛋白70、肽聚糖识别蛋白、Tisll蛋白、氧化酶与抗氧化酶类等。
　　 利用SSRIT软件对虾夷扇贝外套膜cDNA文库的EST数据进行微卫星查找，发现62条含有微卫星的EST序列，占EST总数的10.9％。两碱基重复类型的微卫星序列最多，共50条，占文库中微卫星序列总数的80.6％，其中以(at)n重复最多(16条)。根据这些序列，设计了20对针对微卫星的特异性引物。
　　 虾夷扇贝mtDNA非编码区2(NcR2)具有很高的序列变异性，利用这一特征，采用PCR产物直接测序法对大连獐子岛(ZZD)、大连旅顺口(LSK)、日本青森县(QSX)及俄罗斯海森崴(HSW)4个群体的共40个虾夷扇贝的线粒体NcR2序列进行分析。测序得到14种单元型序列，其中ZZD群体中的单元型类型最多，群体的遗传多样性较高。在4个群体的NcR2序列中，发现15个变异位点，包括9个转换位点、2个颠换位点、4个插入/缺失位点。ZZD群体与LSK群体中均具有与日本群体相同的单元型H2，表明它们之间关系较近。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1.1 虾夷扇贝概述

1.1.1 虾夷扇贝分类学地位

1.1.2 虾夷扇贝的形态学特征

1.1.3 虾夷扇贝的生活习性和繁殖方式

1.1.4 虾夷扇贝线粒体结构及遗传特征分析

1.2 虾夷扇贝的养殖现状

1.3 虾夷扇贝养殖过程中出现的问题

1.4 虾夷扇贝养殖业健康可持续发展的解决办法

1.5 基因文库的构建及应用

1.5.1 基因组文库类型及应用

1.5.2 cDNA文库类型及应用

1.6 cDNA文库中基因克隆与筛选的主要方法

1.6.1 图位克隆技术(Map based cloning or positional cloning)

1.6.2 同源克隆技术(Homology based candidate gene method)

1.6.3 表达序列标签法(Expressed sequence tagging method，EST)

1.7 基于EST的生物信息学分析

研究目的及意义

第二章 虾夷扇贝外套膜CDNA文库的构建

1 引言

2 实验材料与方法

2.1 实验样品来源

2.2 实验主要试剂

2.3 菌株与载体

2.4 SOC培养基

2.5 虾夷扇贝总RNA的提取

2.6 mRNA的纯化及纯度检测

2.7 反转录合成cDNA

2.8 cDNA文库质量检测

3 实验结果

3.1 总RNA的提取

3.2 mRNA纯度检测

3.3 cDNA的合成

3.4 cDNA文库质量检测

4 讨论

第三章 虾夷扇贝cDNA文库中EST序列分析及EST-SSR的筛选

1 引言

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 cDNA文库的构建

2.3 cDNA文库的克隆测序与比对分析

2.4 EST-SSR筛选与引物设计

3结果

3.1 cDNA文库的克隆测序与序列分析

3.2 免疫相关基因的EST序列功能分析

3.3 EST序列中SSR查找与分析

3.4 cDNA文库中微卫星引物设计

4 讨论

4.1 EST序列中免疫相关基因的筛选与分析

4.2 EST-SSR分析

第四章 虾夷扇贝线粒体非编码区多态性研究

1 引言

2 实验材料与方法

2.1 实验样品

2.2 DNA提取

2.3 引物设计

2.4 PCR扩增反应体系

2.5 扩增产物琼脂糖电泳检测

2.6 测序及序列分析

3 结果

3.1 琼脂糖电泳检测结果

3.2 测序结果分析

3.3 单元型多态性分析

3.4 单元型的群体分布

4 讨论

结论

参考文献

致谢

研究生期间论文发表情况