虾夷扇贝beta-actin基因和G型溶菌酶基因的克隆与表达研究

摘要

虾夷扇贝是20世纪80年代有日本引入我国,现已成为我国北方重要的贝类养殖品种,但近年来,虾夷扇贝陆续爆发大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,还严重影响了该产业的健康发展。病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求我们对此进行更加深入的研究。虾夷扇贝中抗病基因的克隆和表达无疑是研究养殖动物免疫防御机制,提高机体抗病力,实现遗传改良的基础和关键。
　　 为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5’端测序,比对,从虾夷扇贝肾脏文库中筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。该cDNA全长为1536bp,5’端非编码区84 bp,3’端非编码区321 bp,编码区1131 bp,编码377个氨基酸；在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其他功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。
　　 从虾夷扇贝外套膜文库中筛选出G型溶菌酶同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到G型溶菌酶基因cDNA全长序列。该基因序列全长为731 bp,5’端非编码区25 bp,3’端非编码区100 bp,编码区606 bp,编码202个氨基酸。经过进一步分段扩增、测序,得到该基因的五个内含子,将该基因分成六个外显子。六个外显子长度分别为55bp,60 bp,90 bp,113 bp,148 bp和140 bp；五个内含子的长度分别为7087 bp,5178bp,3526 bp,710 bp和1400 bp;内含子的两侧都具有RNA正确剪接所必需的识别位点(GT/AG)。采用实时定量PCR方法,检测了虾夷扇贝G型溶菌酶基因在不同组织中的表达以及在菌注射后不同时段G型溶菌酶基因在血细胞中的表达状况。结果发现,该基因主要在外套膜和肝胰腺中表达,在鳃、肾脏、闭壳肌和血细胞中也有微量的表达,在鳗弧菌刺激后的3小时、6小时、9小时三个时段中,G型溶菌酶在血中的表达均显著高于对照组,第12小时、24小时低于对照组,第36小时高于对照组。另外,本研究随机克隆了虾夷扇贝5个不同个体的G型溶菌酶编码区并测序,发现有3个有义突变,由于测序容易产生误差,又对这3个有义突变进行了高通量SNP基因型分析,结果显示有1个有义突变是准确的。为进一步研究其物种的遗传多态性和基因表达差异奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

引言

1 文献综述

1.1 我国贝类养殖现状和面临的问题

1.2 贝类的非特异性免疫防御体系

1.2.1 贝类的细胞免疫与机制

1.2.2 贝类的体液免疫机制

1.3 β-肌动蛋白(beta actin)

1.4 EST结合PCR技术基因克隆

1.4 实时定量PCR技术

1.4 本研究的目的和意义

1.4.1 本研究的目的:

1.4.2 本研究的意义:

2 材料和方法

2.1 样本的采集与处理

2.2 样本的采集与处理

2.2.1 获得β-actin基因cDNA序列

2.2.2 β-actin基因组DNA序列

2.2.3 设计内参引物

2.2.4 β-actin基因系统发育分析

2.3 G型溶菌酶基因的克隆

2.3.1 获得G型溶菌酶基因cDNA序列

2.3.2 G型溶菌酶基因组DNA序列

2.4 虾夷扇贝各组织RNA的提取

2.5 cDNA第一链的合成

2.6 实时定量PCR引物筛选及标准曲线的制作

2.6.1 实时定量PCR引物筛选

2.6.2 标准曲线的制作

2.7 G型溶菌酶在虾夷扇贝各组织的表达

3 结果与讨论

3.1 beta actin基因的克隆与分析

3.1.1 β-actin基因的PCR产物、测序结果

3.1.2 β-actin基因内含子的定位及其序列的测定

3.1.3 内参引物位置

3.1.4 系统发育分析

3.2 G型溶菌酶基因的克隆与表达

3.2.1 G型溶菌酶基因的PCR产物、测序结果

3.2.2 虾夷扇贝G型溶菌酶的基因结构分析

3.2.3 虾夷扇贝G型溶菌酶的分子进化研究

3.2.4 C型、G型和I型溶菌酶的分子进化研究

3.2.5 Real Time PCR标准曲线的制作

3.2.6 虾夷扇贝G型溶菌酶的组织分布

3.2.7 用实时定量PCR检测菌刺激下G型溶菌酶时段表达

3.2.8 G型溶菌酶编码区SNP

4 讨论

5 结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢