绵羊成纤维细胞肌肉生长抑制素(Myostatin)基因敲除的初步研究

摘要

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又名GDF-8(转化生长因子),首次于1997年美国约翰霍普金斯大学医学院Mcpherron科研小组在研究TGF-β(转化生长因子超家族)时采用简并PCR法在该家族的保守区域扩增得以发现。该基因作为骨骼肌特异性生长发育的负调控因子,遗传突变功能失活后能够产生肌肉急剧增加的“双肌表型”。本研究利用基因敲除技术体外构建针对绵羊Myostatin基因第三外显子缺失的基因敲除载体,转染入绵羊成纤维细胞,利用骨架载体上Neo基因替代Myostatin基因的exon3,以期达到使细胞内Myostatin基因失活的目的。对绵羊体细胞Myostatin基因敲除的可行性进行初步探索研究；为创制肉羊育种新材料、培育转基因绵羊奠定基础。本论文主要的研究结果如下:
　　 (1)根据绵羊Myostatin基因全序列(GenBank No.DQ530260)利用LA-PCR技术,成功扩增得到绵羊Myostatin基因同源长臂4.9k,包括全部的exonl,intronl,exon2,及部分启动子和大部分intron2；同源短臂1.1K,包括部分exon3和3’非翻译区序列,将二者连入PloxpⅡ正负筛选基因敲除骨架载体,成功构建专门针对Myostatin第三外显子区域缺失的置换型敲除载体PloxpⅡ-OVIS-MSTN(13.5K),酶切和测序鉴定证明载体构建正确。
　　 (2)通过组织块贴壁的方法建立绵羊耳缘组织成纤维细胞系,增殖活力良好,为后续细胞转染实验奠定基础。
　　 (3)建立了绵羊Myostatin基因敲除载体转染及筛选方法:脂质体2.5ul,敲除载体2ug,转染效率较高；经过300ug／mlG418初步筛选7-10天,而后经200ug／mlG418加50nmol／1GANC维持筛选20天左右可得到明显的细胞克隆。
　　 (4)经过30天左右的正负筛选共得到64个细胞克隆,经PCR鉴定后初步认为12号细胞克隆为发生了同源重组的阳性细胞克隆。
　　 本研究根据Myostatin基因突变可导致肌肉量激增而产生“双肌”表型的特点,利用基因敲除技术使绵羊细胞内Myostatin基因缺失,从而为应用基因敲除及体细胞克隆技术相结合制作产肉率高的转基因肉羊建立技术研究平台,为肉羊育种及品种改良提供新思路。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 肌肉生长抑制素基因(Myostatin)的研究进展

1.1.1 肌肉生长抑制素基因的发现

1.1.2 肌肉生长抑制素基因及蛋白结构特点

1.1.3 肌肉生长抑制素基因的表达

1.1.4 TGF-β和Myostatin信号通路

1.1.5 肌肉生长抑制素基因的功能及研究意义

1.1.6 展望

1.2 基因敲除技术的研究进展

1.2.1 基因敲除的原理

1.2.2 基因敲除的载体设计

1.2.3 基因敲除阳性中靶细胞的筛选

1.2.4 同源重组细胞克隆的鉴定

1.2.5 基于Cre/loxp重组酶系统的条件性基因敲除

1.3 基因敲除结合体细胞克隆技术在转基因家畜研究中的应用

1.3.1 转基因动物的制作方法

1.3.2 家畜体细胞克隆技术

1.3.3 家畜体细胞基因敲除

1.3.4 展望

1.4 本研究的目的及意义

1.5 本研究的技术路线

2.绵羊肌肉生长抑制素基因(Myostatin)敲除载体的构建

2.1 材料与方法

2.1.1 实验动物材料

2.1.2 质粒与菌株

2.1.3 主要试剂及实验仪器

2.1.4 使用的生物软件及数据库

2.1.5 溶液试剂的配置

2.2 方法

2.2.1 绵羊血液基因组DNA的提取

2.2.2 绵羊Myostatin基因同源臂的获得

2.2.3 同源长短臂的胶回收纯化

2.2.4 同源臂的亚克隆

2.2.5 同源长短臂亚克隆连接产物的转化及筛选

2.2.6 阳性克隆质粒小提

2.2.7 阳性克隆质粒双酶切及测序鉴定

2.2.8 PloxpII-OVIS-MSTN敲除载体的构建

2.3 结果与分析

2.3.1 绵羊血液基因组DNA提取

2.3.2 绵羊Myostatin基因同源臂扩增结果

2.3.3 同源长短臂胶回收纯化检测结果

2.3.4 同源长短臂亚克隆质粒小提及酶切鉴定

2.3.5 终载体PloxpII-OVIS-MSTN酶切鉴定

2.4 讨论

2.4.1 绵羊Myostatin基因敲除载体的设计

2.4.2 大片段同源臂的获得

2.4.3 同源臂与骨架载体的重组连接

3.绵羊耳组织成纤维细胞系的建立

3.1 材料与方法

3.1.1 实验动物材料

3.1.2 细胞培养实验耗材及试剂

3.1.3 主要实验仪器及设备

3.1.4 溶液试剂的配置

3.2 方法

3.2.1 绵羊耳组织取材及处理

3.2.2 组织块贴壁法原代培养绵羊耳成纤维细胞

3.2.3 绵羊耳成纤维细胞传代

3.2.4 绵羊耳成纤维细胞的冻存与复苏

3.2.5 绵羊耳成纤维细胞生长曲线的绘制

3.3 结果与分析

3.3.1 组织块贴壁法原代培养绵羊耳成纤维细胞的结果

3.3.2 细胞的冻存与复苏

3.3.3 绵羊耳成纤维细胞生长曲线

3.4 讨论

3.4.1 绵羊耳组织成纤维细胞的原代培养

3.4.2 绵羊耳组织成纤维细胞培养过程中的形态及生长变化规律

4.PloxplI-OVIS-MSTN敲除载体转染绵羊耳成纤维细胞方法的建立

4.1 材料与方法

4.1.1 质粒菌株及主要试剂

4.1.2 主要仪器设备

4.2 方法

4.2.1 绵羊耳组织成纤维细胞G418毒性检测

4.2.2 PloxpII-OVIS-MSTN敲除载体质粒大量提取

4.2.3 PloxpII-OVIS-MSTN敲除载体质粒酶切线性化及纯化

4.2.4 PloxpII-OVIS-MSTN敲除载体脂质体转染绵耳成纤维细胞

4.2.5 阳性细胞克隆的药物筛选及鉴定

4.3 结果与分析

4.3.1 G418毒性检测结果

4.3.2 PloxpII-OVIS-MSTN敲除载体质粒大提结果

4.3.3 PloxpII-OVIS-MSTN敲除载体脂质体转染绵羊耳成纤维细胞结果

4.3.4 阳性细胞克隆的筛选结果

4.3.5 细胞克隆PCR鉴定结果

4.4 讨论

4.4.1 敲除载体质粒大提及酶切线性化纯化后的回收得率

4.4.2 敲除载体脂质体转染绵羊耳成纤维细胞

4.4.3 细胞克隆G418及GANC的双重药物筛选

4.4.4 阳性细胞克隆的扩大培养及鉴定

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢