裙带菜SAMS基因的克隆、分析及原核表达

摘要

本实验采用改良的SDS提取方法从裙带菜配子体中提取总RNA。通过设计简并引物克隆裙带菜S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(UpSAMS)。获得的基因cDNA序列全长为1491bp,并编码397个氨基酸,预测蛋白分子量为43.2 KDa,等电点为5.244。起始密码子为ATG,终止密码子为TAA。5’非翻译区(UTR)长度为92 bp,3'UTR长度为205bp,氨基酸序列中包含42个碱性氨基酸,57个酸性氨基酸,132个疏水性氨基酸和93个极性氨基酸。氨基酸序列还包含两个特定基序,第一个特定基序为GAGDQG,位置在氨基酸序列的127-132之间,第二个特定基序为GGGAFSgKD,位置在274-282之间。BLASTx比对显示裙带菜SAMS基因编码的蛋白(UpSams)序列与已发表的其他物种序列的相似度在68％-96％。结果表明裙带菜SAMS基因与藻类的相似度高于高等植物。进化树结果显示裙带菜SAMS基因首先和同属褐藻的海带和水云聚在一起,然后再与绿藻,红藻和硅藻聚合,最后再和十几种高等植物聚类。进化分析表明,裙带菜与其他海藻Sams亲缘关系要近于高等植物。疏水性分析结果显示UpSams亲水性最强是第339位的甘氨酸,疏水性最强是第314位赖氨酸。磷酸化分析显示丝氨酸有10处,苏氨酸有4处,酪氨酸有3处可能被磷酸化。不同的胁迫条件下,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测UpSAMS基因的相对表达量的变化水平,结果表明UpSAMS基因与抗逆相关。将UpSAMS基因转入大肠杆菌表达菌株BL21中进行原核表达,SDS-PAGE电泳结果显示UpSAMS基因已经结合在pGEX4T-1表达载体上,并形成了融合蛋白。
　　 裙带菜SAMS基因的克隆分析和表达为今后进一步研究该基因的抗性机理奠定了重要的基础。

目录

文摘

英文文摘

引言

1 文献综述

1.1 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因

1.2 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的结构及催化机理

1.3 S-腺苷甲硫氨酸参与多胺合成的途径

1.4 S-腺苷甲硫氨酸的生物学意义

1.4.1 转甲基

1.4.2 转硫基

1.4.3 转氨丙基

1.5 本实验研究内容及意义

2 裙带菜S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)的克隆、分析

2.1 材料培养

2.2 仪器设备及药品

2.2.1 仪器设备

2.2.2 试剂及耗材

2.3 实验方法

2.3.1 裙带菜配子体RNA的提取与纯化

2.3.2 反转录

2.3.3 裙带菜SAMS基因的克隆

2.3.4 3'-Full RACE

2.3.5 5'-Full RACE

2.3.6 PCR产物的纯化,亚克隆及测序

2.3.7 实时荧光定量PCR

2.4 结果与分析

2.4.1 裙带菜RNA电泳检测

2.4.2 裙带菜SAMS基因的克隆

2.4.3 菌落PCR检测

2.4.4 序列分析

2.4.5 实时荧光定量PCR

2.5 讨论

3 裙带菜SAMS基因的原核表达

3.1 试剂配置

3.2 操作步骤

3.2.1 获得目的基因

3.2.2 构建重组表达载体

3.2.3 检测重组表达菌株

3.2.4 诱导表达

3.2.5 SDS-PAGE电泳检测(采用垂直式电泳槽装置)

3.3 实验结果

3.3.1 裙带菜SAMS基因开放阅读框的克隆及重组质粒的构建

3.3.2 SDS-PAGE电泳检测

3.4 实验讨论

4 结论

参考文献

附录 A 附录内容名称

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢