间充质干细胞(MSCs)神经向诱导实验条件优化及胞内钙离子浓度动态变化

摘要

目的：分离提取骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)及脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)比较二者生物学特性及体外增殖能力，并探讨三种不同成神经诱导方法对AMSCs向神经样细胞分化过程中的影响，提高AMSCs向神经样细胞分化诱导效率，从而为研究AMSCs向神经样细胞分化机制奠定基础。深入探讨成球诱导方法中细胞内钙离子浓度变化，有助于阐明AMSCs的成神经诱导分化机理，为AMSCs在临床再生医学上的应用提供理论依据。
　　 方法：(1)采用密度梯度离心法分离BMSCs及酶消化法体外分离AMSCs。检测MSCs的表面抗原以及将MSCs进行体外成骨诱导，成脂诱导对MSCs的干细胞特性进行鉴定。(2)三种诱导方案诱导AMSCs向神经样细胞分化，包括化学诱导方法、鼠脑条件培养基诱导方法、成神经球分化诱导方法。观察诱导中的形态变化，免疫荧光检测神经细胞特异性标志物β-Ⅲ-Tubulin，NSE和Nissl的表达。确定最高效的诱导方法。(3)采取成神经球诱导方法对AMSCs进行诱导，利用Fluo3/AM对AMSCs及诱导过程中的类神经细胞进行染色，通过流式细胞仪对AMSCs群体细胞的钙离子浓度检测，并通过共聚焦显微镜确定单个细胞中钙离子浓度的变化，研究细胞内游离钙离子浓度在AMSCs向神经样细胞分化过程中的变化。
　　 结果：(1)获得的BMSCs及AMSCs可稳定传至20代以上。表型鉴定结果为CD13、CD90阳性，CD34、CD45阴性，AMSCs的CD106阴性，BMSCsCD106表达弱阳性。成骨细胞分化28d时，Von kossa阳性，向脂肪细胞分化14d时，油红O染色阳性。(2)用化学因子诱导AMSCs向神经样细胞分化，30d时出现成熟神经元标记NSE的表达，阳性值为29.5％，但细胞凋亡明显。鼠脑条件培养基诱导14d时，NSE略有表达，值为12.8％。采用成神经球诱导方法进行7d成神经球诱导，再经过7-9天的分化培养。在7d时有8.9％NSE表达。β-Ⅲ-Tubulin及Nissl在经三种诱导方法诱导成熟后，均为阳性表达。(3)成球法诱导AMSCs向神经样细胞分化过程中，取AMSCs及诱导不同时间点的成神经细胞从细胞整体及个体角度分别证实：在成球诱导法诱导下，通过7天成神经球后，在继续的分化过程1-6天时细胞内钙离子浓度先呈上升趋势，在分化7-9天时达到高峰，随后急剧下落，与细胞培养时细胞发生凋亡的时间一致。
　　 结论：AMSCs较BMSCs具有较高的增殖能力，神经球分化方法更能够高效低损伤的诱导AMSCs分化为类神经细胞，细胞内游离钙离子在AMSCs向神经样细胞分化过程中会发生变化，对维持细胞分化，存活均起到了一定的作用。