葡萄查耳酮合酶基因克隆及表达分析

摘要

类黄酮物质的合成途径中的关键酶为查耳酮合酶(chalcone synthase，CHS)，它催化3分子的丙二酰辅酶A(malonyl CoA)与1分子的香豆酰CoA(coumaryl CoA)生成4，5，7-三羟基黄烷酮(narigenin chalcone)。葡萄果实中含有极其丰富的营养物质，其中包括多酚类物质，是一种大众性水果，常用于鲜食、制成果汁、葡萄干和葡萄酒等。但葡萄的抗逆性较差，易受环境影响，导致其产量和质量下降。
　　为探讨CHS基因在葡萄植株防御体系中的作用，以及在次生代谢物合成中的作用，本实验进行如下研究:
　　1.实验中，以NCBI和TIGR数据库为基础，采用RT-PCR技术，从葡萄中成功克隆得到两个查耳酮合酶(CHS)的cDNA开放阅读框（ORF）序列VvCHS1和VvCHS3。其中，VvCHS1序列长1182bp，编码393个氨基酸;VvCHS3序列长1170bp，编码389个氨基酸。
　　2.在TIGR基因索引数据库中，以Grape和chalcone synthase为关键词进行搜索，查询出具有同源性的VvCHS基因的所有EST序列。利用NCBI的ORF Finder程序，对得到的序列进行ORF预测，结果显示具有完整ORF的序列共5个，并利用软件对其进行生物信息学分析。分析内容包括:各种氨基酸的组成（种类及数量），以及蛋白的一级结构和理化性质（信号肽和跨膜结构域等）、疏水性、二级结构、三级结构，启动子中含有的顺式作用元件和进化分析等。
　　3.葡萄叶片经过紫外线(UV)辐射和水杨酸(SA)喷洒处理后，采用实时荧光定量PCR技术，对VvCHS1和VvCHS3的表达量的变化情况进行分析。通过实验和数据分析处理，得出结论:在不同的处理条件下，二者的相对表达量均出现了具有一定的规律性的变化，结果显示为先上升后缓慢下降趋势，且都在12h处表达量达到最高值。这表明VvCHS1和VvCHS3基因通过调节表达量参与植物抗逆过程。
　　本文对葡萄查耳酮合酶VvCHS1和VvCHS3基因克隆，以及对其所编码蛋白的理化性质和进化关系分析，为进一步研究该基因的功能及其在葡萄适应性机制中的调节作用以及代谢转换奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 类黄酮的基本概况

1．1．1 类黄酮的结构、种类及分布

1．1．2 类黄酮的生理功能及应用

1．1．3 类黄酮的生物合成途径

1．1．4 类黄酮合成代谢的调控

1．2 查耳酮合酶的研究概况及进展

1．2．1 CHS基因的结构

1．2．2 CHS基因的进化

1．2．3 CHS蛋白的催化机制

1．2．4 CHS基因的表达调控

1．3 生物信息学简介

1．3．1 生物信息学学科的诞生

1．3．2 生物信息学的研究概况

1．3．3 生物信息学的研究内容

1．3．4 生物信息学在分子生物学中的应用

1．4 实时荧光定量PCR

1．5 本实验研究内容及意义

2 葡萄CHS基因的克隆以及生物信息学分析

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 实验材料、试剂与耗材

2．1．2 溶液的配制

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 序列的获得

2．2．2 葡萄CHS基因的克隆

2．2．3 生物信息学分析

2．3 结果

2．3．1 序列的获得

2．3．2 葡萄CHS基因的克隆

2．3．3 葡萄CHS基因的生物信息学分析

2．4 讨论

3 葡萄CHS基因在不同处理条件下的诱导表达

3．1 材料处理

3．2 RNA的提取、纯化及cDNA的合成

3．3 引物设计

3．4 实时荧光定量PCR

3．5 结果

3．5．1 葡萄RNA电泳检测

3．5．2 实时荧光定量PCR

3．6 讨论

4 结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢