rLj-RGD3对卵巢癌HeyA8细胞活性影响及机制研究

摘要

卵巢癌是在卵巢组织发生的恶性肿瘤，临床上通常因其症状不明显而导致患者死亡率较高。目前，相关于卵巢癌的早期诊断和治疗仍面临许多不足，因此深入探讨卵巢癌的发病机制以及筛选高效、副作用小的新型抗肿瘤药物已成为当今医疗研究领域中的重点。RGD(Arg-Gly-Asp)模体是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的短肽序列，能够特异识别细胞表面部分的整合素。近年来，陆续有大量研究关注于RGD短肽在抗肿瘤等方面的应用。尽管前期研究已经报道了来自于七鳃鳗口腔腺的重组多肽Lj-RGD3(recombinant Lj-RGD3，rLj-RGD3)不仅能够抑制血小板聚集，还能够诱导内皮细胞(ECV304)、乳腺癌细胞和肝癌细胞发生凋亡，但是相关于rLj-RGD3对卵巢癌HeyA8细胞的作用及机制还未有任何研究报道。
　　本研究首次分析了rLj-RGD3对卵巢癌HeyA8细胞增值的抑制作用，并详细探讨了其作用机制。MTT结果表明rLj-RGD3能够以剂量依赖性的方式显著抑制HeyA8细胞的增值，其IC50为10μM。LDH活性分析结果表明rLj-RGD3能够破坏HeyA8的细胞膜并释放LDH，但是活性较弱，表明rLj-RGD3对HeyA8细胞较弱的毒性也是抑制其增值的因素之一。Hoechst33258染色结果显示rLj-RGD3能够促使HeyA8细胞内染色质发生固缩，且Annexin V和PI双染结果显示rLj-RGD3能够增加HeyA8细胞的早期和晚期凋亡比例。这表明rLj-RGD3能够诱导HeyA8细胞发生凋亡。本研究通过采用流式细胞术及western blot的方法证实了rLj-RGD3是通过改变线粒体膜电位、细胞骨架的排列、胞内凋亡相关蛋白的表达水平、钙离子的浓度以及MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平来诱导HeyA8细胞发生凋亡。此外，粘附实验结果表明rLj-RGD3能够通过竞争性结合整合素来抑制HeyA8细胞粘附到细胞外基质蛋白，如纤连蛋白、胶原Ⅳ以及层粘连蛋白。这表明rLj-RGD3能够识别多种类型的整合素分子。最后，Transwell实验和western blot实验结果表明rLj-RGD3能够通过下调HeyA8细胞内磷酸化粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)的含量来抑制HeyA8细胞的迁移及浸润过程。综上，rLj-RGD3对卵巢癌HeyA8细胞的增值具有明显的抑制作用。这为今后临床上以rLj-RGD3治疗卵巢癌患者奠定了深厚的理论基础，具有潜在的经济效益和应用前景。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 整合素(Integrins)

1．1．1 整合素的结构

1．1．2 整合素的功能

1．1．3 整合素在肿瘤组织中的异常表达

1．1．4 整合素作为抗肿瘤药物的靶点

1．2 RGD模体相关生物学特征

1．2．1 RGD模体在抗肿瘤治疗中的应用

1．2．2 来自于吸血动物的RGD模体毒素肽

1．3 问题的提出

2 七鳃鳗RGD3的重组表达与纯化

2．1 材料

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 方法

2．2．1 rLj-RGD3重组蛋白的表达及纯化

2．2．2 使用Tricine SDS-PAGE电泳检测纯化的蛋白

2．2．3 BCA法绘制蛋白标准曲线测定纯化后的蛋白浓度

2．3 结果

2．3．1 SDS-PAGE鉴定rLj-RGD3重组蛋白

2．3．2 测定rLj-RGD3蛋白浓度

2．4 讨论

2．5 小结

3 rLj-RGD3抑制HeyA8细胞的增殖且能够诱发HeyA8细胞释放LDH

3．1 材料

3．1．1 实验试剂

3．1．2 实验仪器

3．2 方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 MTT方法检测细胞增值率

3．2．3 乳酸脱氢酶细胞毒性检测

3．3 结果

3．3．1 rLj-RGD3抑制HeyA8细胞的增殖

3．3．2 rLj-RGD3诱发HeyA8细胞释放LDH

3．4 讨论

3．5 小结

4 rLj-RGD3诱导HeyA8细胞凋亡

4．1 材料

4．1．1 实验试剂

4．1．2 实验仪器

4．2 方法

4．2．1 HeyA8细胞形态观察

4．2．2 荧光染色观察HeyA8细胞骨架和细胞核

4．2．3 流式细胞术检测HeyA8细胞凋亡

4．2．4 流式细胞术检测HeyA8细胞线粒体膜电位

4．2．5 rLj-RGD3对HeyA8细胞内Ca2+浓度检测

4．2．6 rLj-RGD3对HeyA8细胞内活性氧浓度检测

4．2．7 免疫印迹检测凋亡相关蛋白

4．3 结果

4．3．1 rLj-RGD3能够改变HeyA8细胞的形态

4．3．2 rLj-RGD3能够引起HeyA8细胞骨架和核形态的改变

4．3．3 rLj-RGD3诱导HeyA8细胞发生凋亡

4．3．4 rLj-RGD3能够促使HeyA8细胞线粒体的膜电位发生下降

4．3．5 rLj-RGD3能够改变HeyA8细胞内BCL2、BAX以及裂解后caspase-3的含量

4．3．6 rLj-RGD3对HeyA8细胞内Ca2+浓度的影响

4．3．7 rLj-RGD3对HeyA8细胞内活性氧自由基含量的影响

4．3．8 rLj-RGD3对HeyA8细胞内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路的影响

4．4 讨论

4．5 小结

5 rLj-RGD3能够阻断HeyA8的粘附、迁移及侵袭过程

5．1 材料

5．1．1 实验试剂

5．1．2 实验仪器

5．2 方法

5．2．1 rLj-RGD3对HeyA8细胞的粘附作用

5．2．2 rLj-RGD3对HeyA8细胞的迁移作用

5．2．3 rLj-RGD3对HeyA8细胞的侵袭作用

5．3 结果

5．3．1 rLj-RGD3能够抑制HeyA8的粘附

5．3．2 rLj-RGD3能够抑制HeyA8的迁移

5．3．3 rLj-RGD3能够抑制HeyA8的侵袭

5．3．4 rLj-RGD3能够抑制HeyA8内FAK的激活

5．4 讨论

5．5 小结

结论

参考文献

本论文的创新点

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢