云南地衣放线菌资源和多样性研究

摘要

位于我国西南边陲的云南省，是众多特殊生物类群的重要栖息地和天然基因库，也是我国地衣物种多样性最丰富的地区之一。地衣是由共生菌(mycobiont)和共生藻(photobiont)互惠共生形成的一类特殊化真菌复合体。前期对地衣微生物的研究发现地衣中蕴藏着丰富而独特的放线菌资源。本研究以多种地衣为研究对象，通过免培养和纯培养手段对地衣放线菌的群落组成和物种多样性进行分析;从抗菌活性、抗生素合成基因筛选及代谢物多样性三个角度对纯培养放线菌进行生物合成能力的评估;并从中优选出一株抗菌活性好的纯培养菌株，对其进行了次级代谢产物研究，挖掘地衣放线菌潜在的药学应用价值。具体研究结果包括: 第一，通过Illumina MiSeq高通量测序技术对不同来源的9份地衣样本中细菌多样性进行了研究。共得到509134条细菌16S rRNA基因V3和V4区有效序列，在99％的序列相似性水平下对其进行归并，共获得11075个操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，通过对OTUs进行注释，发现了32个门的古菌和细菌类群，其中变形菌门、蓝细菌门、厚壁菌门和放线菌门占绝对优势。在门水平未能鉴定的序列有7563条，表明在地衣中蕴藏着众多分类地位很高的未知类群。在不同海拔的同种地衣中，高海拔地区的地衣微生物多样性要比低海拔的多样性显著降低。在97％的水平下，共有1831个OTUs归属于放线菌门，并且存在大量未知的新类群。 第二，首次较为系统的研究了地衣放线菌的分离方法。发现通过简单的两步预处理方法，即流水冲洗5min，然后用三份无菌水(各20mL)浸洗三次，能够有效的除去地衣表面的微生物，排除其对地衣放线菌分离时的干扰。在分离培养基中添加多种抑制剂（制霉菌素100mg/L、重铬酸钾50mg/L、萘啶酮酸40mg/L）能够显著抑制真菌和革兰氏阴性细菌的生长，同时增加放线菌的种类和数量。 第三，从68份云南地衣样品中共分离地衣放线菌2415株，选择545株代表性菌株进行分类鉴定，其中共获得放线菌462株，涵盖183个种，分别归属于放线菌纲的11个目，23个科，47个属:马杜拉放线菌属(Actinomadura)、游动放线菌属(Actinoplanes)、壤霉菌属(Agromyces)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、节细菌属(Arthrobacter)、芽球菌属(Blastococcus)、短杆菌属（Brevibacterium）、纤维菌属(Cellulomonas)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)、短小杆菌属（Curtobacterium）、弗莱德门菌属(Friedmanniella)、戈登氏菌属(Gordonia)、草药菌属(Herbiconiux)、两面神菌属(Janibacter)、拟孢囊菌属Kibdelosporangium)、动球菌属(Kineococcus)、动孢菌属(Kineosporia)、北里孢菌属(Kitasatospora)、考克氏菌属(Kocuria)、韩国生工属(Kribbella)、拉贝达氏菌属(Labedella)、列舍瓦里尔菌属(Lechevalieria)、赖氏菌属(Leifsonia)、伦茨氏菌属(Lentzea)、微杆菌属（Microbacterium）、微球菌属(Micrococcus)、小月菌属(Microlunatus)、小单孢菌属(Micromonospora)、移杆菌属(Motilibacter)、分枝杆菌属Mycobacterium）、诺卡氏菌属(Nocardia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、野野村菌属(Nonomuraea)、植物杆菌属(Plantibacter)、假诺卡氏菌属Pseudonocardia)、红球菌属(Rhodococcus)、舒曼氏菌属(Schumannella)、链霉菌属Streptomyces)、链孢囊菌属Streptospor angium）、梅泽宾夫氏菌属(Umezawaea)、威廉姆斯氏菌属(Williamsia)、Actinophytocola、Amnibacterium、Angustibacter、Flexivirga、Nakamurella。其中24个属的放线菌为首次从地衣中分离得到。在地衣放线菌中，链霉菌属的数量最多，其次为微杆菌属、红球菌属和小单孢菌属。这些结果表明，地衣中蕴藏着多样性极其丰富的放线菌资源亟待我们发掘。 第四，在纯培养获得的地衣放线菌中，共有11.90％的菌株代表着潜在的新物种。其中88.89％的假诺卡氏菌属菌株为新种;小月菌属、类诺卡氏菌属、草药菌属、拟孢囊菌属、舒曼氏菌属和Nakamurella属的全部菌株均为潜在的新物种。表明云南地衣是放线菌新物种的一个重要来源。 第五，对462株地衣放线菌进行了拮抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的活性检测，共有110株放线菌对至少一种指示菌表现出了良好的抗菌活性。抑菌活性菌株主要分布在链霉菌属、拟无枝酸菌属、伦茨氏菌属、类诺卡氏菌属和小月菌属。此外，获得的全部微球菌属、纤维微菌属、两面神菌属、移杆菌属、拟孢囊菌属和梅泽宾夫氏菌属菌株都具有抗菌活性。有超过一半的菌株（259株，56.06％）至少含有一种抗生素合成基因(PKSI,PKSII,NRPS,APH,HMG-CoA，CYP)，在链霉菌属和拟无枝酸菌属中抗生素合成基因比例最高。有超过一半的地衣放线菌（233株）其最相近菌株能够产生丰富多样的活性代谢产物。从相近菌株中共检索到164种活性代谢产物，包括抗生素、酶、酶抑制剂、免疫调节剂、有机酸和氨基酸等。结果显示地衣放线菌有强大的活性次级代谢物合成的潜力。 第六，对一株地衣放线菌Streptomyces hebeiensis YIM130410次级代谢产物进行了研究。共分离得到8个单体化合物，其中4个为新化合物:4aβ,10aa-dihydroxy nanaomycinβA(1),4aβ,10aβ-dihydroxy-nanaomycinβA(2),4aα,10aβ-dihydroxy-nanaomycinβA(3)，10β-hydroxy-nanaomycinαE(4)。其中两个已知化合物nanaomycinαA(5)和nanaomycinβA(6)具有较强的抗菌活性。表明地衣放线菌是获得新颖次级代谢产物的一个重要来源。 综上，本研究论文对地衣放线菌资源和多样性进行了探讨，从地衣放线菌新物种和产生活性次级代谢产物的能力等角度对其评价和解析。为促进了地衣放线菌资源的保护和利用提供理论和实践基础。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第1章引言

1．1地衣概述

1．2地衣微生物的研究现状

1．2．1地衣微生物免培养研究

1．2．2地衣微生物纯培养研究

1．3地衣放线菌的研究现状

1．4地衣放线菌代谢产物研究

1．5地衣放线菌研究存在的问题

1．6研究目的和意义

第2章地衣免培养细菌多样性研究

2．1材料与方法

2．1．1地衣样品信息

2．1．2地衣样品DNA的提取

2．1．3 16S rRNA基因V3和V4区的PCR扩增

2．1．4 Illumina MiSeq PE300上机测序

2．1．5 OUT聚类与系统发育分析

2．1．6序列多样性评价

2．1．7地衣细菌和地衣放线菌群落结构分析

2．2结果与讨论

2．2．1地衣样品测序结果及取样深度分析

2．2．2样本序列的多样性评价

2．2．3地衣样品菌群多样性组成分析

2．3本章小结

第3章云南地衣放线菌纯培养多样性研究

3．1地衣样品预处理方法的探索

3．1．1材料与方法

3．1．2结果与讨论

3．2 68份地衣放线菌选择性分离与多样性分析

3．2．1材料与方法

3．2．2结果与讨论

3．3本章小结

第4章地衣放线菌抑菌活性及生物合成潜力研究

4．1材料与方法

4．1．1实验菌株

4．1．2抑菌活性所用的指示菌

4．1．3菌株培养和发酵

4．1．4地衣放线菌抑菌活性检测

4．1．5抗生素合成功能基因的扩增

4．1．6抗生素合成基因的克隆

4．1．7最相近菌株产代谢物多样性检索

4．2结果与讨论

4．2．1地衣放线菌的抗菌活性

4．2．2地衣放线菌抗生素合成功能基因分布

4．2．3最相近菌株代谢物多样性

4．3本章小结

第5章地衣放线菌Streptomyces hebeiensis次级代谢产物研究

5．1材料与方法

5．1．1实验菌株

5．1．2主要实验仪器与试剂

5．1．3菌株活化与小量发酵培养基

5．1．4小量发酵与发酵液处理

5．1．5扩大发酵培养基的筛选

5．1．6扩大发酵

5．1．7菌株YIM 130410代谢产物分离

5．1．8化合物的结构鉴定与解析

5．1．9化合物的抗菌活性

5．2结果与讨论

5．2．1发酵培养基的筛选

5．2．2菌株YIM 130410代谢产物分离与鉴定

5．2．3化合物波谱数据解析与理化性质

5．2．4化合物的抗菌活性

5．3本章小结

第6章总结与展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间取得的学术成果

个人简介

新化合物附图