电穿孔介导的可调控人胰岛素基因肌肉转染对糖尿病小鼠的降糖作用

摘要

目的:通过导入外源胰岛素基因以补充体内胰岛素的不足,是经典的糖尿病基因治疗思路.成功的基因治疗有赖于体内治疗基因长期、有效、可调控的表达.目前,电穿孔(Electroporation,EP)作为一种有前途的体内基因导入手段,既避免了病毒载体安全性的担忧,又克服了裸质粒单纯注射转染率较低的缺点,可以实现胰岛素基因长期有效的表达.但持续的胰岛素表达势必会有低血糖的危险.所以,胰岛素基因的调控,即使其表达随血糖变化这一生理需要是基因治疗的关键问题.四环素调控系统是一种广泛应用而且安全有效的调控方法.通过给药/撤除四环素或其衍生物可启动/关闭目的基因的表达.已有应用于胰岛素基因调控的试验报道.在该实验的前期研究中发现Balb/C糖尿病小鼠裸质粒单纯肌肉注射后,血糖降低仅维持约2周.而在昆明种糖尿病小鼠的尝试中发现,一次单纯肌肉注射可以实现约7周的血糖控制.且两种系糖尿病小鼠的胰岛素表达均可实现四环素系统的体内调控.基于以上的前期探索,利用电穿孔可以增强外源基因的体内转移效率,该实验采用电穿孔介导含有人胰岛素基因的目的质粒prTA-tet4-rhINS转染昆明种糖尿病小鼠的肌肉组织,旨在探讨电穿孔增强的质粒prTA-tet4-rhINS基因治疗的可行性与安全性.方法:1.利用大肠杆菌大量扩增、提取并纯化该实验室构建的可被骨骼肌细胞Furin蛋白酶酶切成熟的胰岛素原表达质粒prTA-tet4-rhINS.2.以链脲佐菌素(STZ)诱导昆明小鼠成糖尿病模型.3.成模小鼠分为三组:①EP-ptetINS组(42只):为强力霉素调控的目的质粒INS(prTA-tet4-rhINS)电穿孔组,该组每只小鼠每侧后腿股部股肉注射目的质粒INS150μg,每只小鼠共注射质粒300μg;注射后5分钟内,在注射部位两侧与注射方向平行插入两根电极针,并将其与转基因仪连接,给予方波电脉冲刺激(电压200V/cm,波宽40ms,脉冲次数6次,频率1Hz);②EP-pLNCX组(35只):为不含INS基因的空质粒pLNCX电穿孔对照组,与上组转染方法相同,但转染质粒为空质粒pLNCX;③Nake-ptetINS组(48只):为强力霉素调控的目的质粒INS(prTA-tet4-rhINS)单纯肌肉注射组.该组小鼠每侧后腿股部注射目的质粒INS150μg,每只小鼠共注射质粒300μg,注射后不予电穿孔.各组转染后立即予饮浓度为2mg/ml强力霉素(Doxycycline,Dox)水.4.每日上午8点葡萄糖氧化酶试纸法检测鼠尾末梢血糖并秤量各组小鼠体重;ELISA检测小鼠血清真胰岛素;RT-PCR方法证实人胰岛素原基因在小鼠肌肉组织中mRNA水平上的表达;5.通过Dox给药/撤除以评价四环素系统调控人胰岛素表达的可行性.结论:1.强力霉素调控的人胰岛素基因可以成功地转染糖尿病小鼠肌肉组织,实现较为持久的降糖作用,同时尿量减少,体重稳定增加,降低了因STZ毒性所致的糖尿病小鼠较高的死亡率.2.电穿孔介导的质粒prTA-tet4-rhINS转染较裸质粒单纯注射转染率更高,基因表达持续时间更长,表达水平更高,表达失效后重复转染同样有效,且个体差异降低,24小时禁食后,糖尿病小鼠血糖水平与非糖尿病小鼠无显著性差异,并且无低血糖发生,从而证实了它是较为安全有效的基因治疗的转染手段.3.通过给药/撤除Dox,可以实现对人胰岛素原基因表达的开关调控,为分泌蛋白的人为体内调控的可行性提供了依据.

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 电穿孔及其介导的体内转导在基因治疗中的应用

参考文献

致谢