平滑肌肌球蛋白功能的非钙依赖性调节机制研究

摘要

该研究发现了MLCK的一个活性片段、痕量调宁蛋白及蛋白激酶A等均可以非钙依赖性方式调节肌球蛋白的功能,可能对低Ca<'2+>水平时平滑肌张力的维持起一定的作用.这些发现不仅促进了平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制的研究,而且为平滑肌系统疾病的治疗以及新药开发提示了新的途径,具有一定的理论意义和应用价值.第一部分 肌球蛋白轻链激酶活性片段对肌球蛋白轻链的非钙依赖性和钙依赖性磷酸化作用及作用特征 肌球蛋白和MLCK均从新鲜鸡胃平滑肌组织中提取纯化;用Trypsin水解MLCK,经纯化后获得61KD MLCK活性片段(MLCKF);用Western blot检测并证实MLCKF与完整MLCK的同源性;利用基因重组大肠杆菌表达并提取钙调蛋白(CaM);将所得蛋白用于肌球蛋白轻链磷酸化反应,并以SDS-PAGE及Scoin Image密度扫描软件检测MLC<,20>磷酸化的程度;用分光光度法测定肌球蛋白MgATP酶的活性.第二部分 痕量调宁蛋白对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用 肌动蛋白从兔骨骼肌丙酮干粉中提取纯化;调宁蛋白(calponin)从新鲜鸡胃平滑肌组织中提取纯化;肌球蛋白、MLCK及CaM的提取纯化方法同前;分别前MLCK和PKA用于肌球蛋白轻链磷酸化反应;再将不同磷酸化状态的肌球蛋白和肌动蛋白用于蛋白结合实验,以检测它们与痕量调宁蛋白的结合能力;肌球蛋白MgATP酶活性的检测方法同前.第三部分 蛋白激酶A对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用 蛋白提取方法同前;将PKA和ACAD用于肌球蛋白轻链磷酸化反应,并以前述方法检测MLC<,20>磷酸化的程度;将不同磷酸化状态的肌球蛋白用于蛋白结合实验,以检测它们与痕量调宁蛋白的结合能力;用分光光度法测定肌球蛋白MgATP酶活性,检测PKA对MgATP酶活性的影响.综上所述,61KD MLCK活性片段、痕量调宁蛋白及蛋白激酶A等都能以非钙依赖性方式调节平滑肌的收缩活动,这三种调节方式都是前人从未报道过的.这些发现进一步促进了平滑肌收缩的非钙依赖性调节理论的研究,并为平滑肌系统疾病的治疗以及新药开发提示了新的途径;该研究结果已得到国内外同行专家们的一致认可,相关论文已有五篇发表于国家级核心期刊,其中一篇被SCI收载.

目录

平滑肌肌球蛋白功能的非钙依赖性调节机制研究

前言

仪器设备、主要材料和方法

参考文献

第一部分肌球蛋白轻链激酶活性片段对肌球蛋白轻链的非钙依赖性和钙依赖性磷酸化作用及作用特征

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分痕量调宁蛋白对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分蛋白激酶A对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分基因重组钙调蛋白提取纯化的新方法

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

致谢

综述：平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制

参考文献

个人简历

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