Rac1蛋白活化与内皮细胞通透性和细胞骨架改变的相关研究

摘要

研究背景及目的:近年人们对EC肌动蛋白骨架的内在调节机制,以及病理情况下骨架蛋白重新分布(reorganization)的信号转导机制及与细胞间隙变化的相关关系进行了一定的研究,认为Rho家族的GTP酶(Rho GTP ases)可能在细胞因子和炎症介质所致的内皮通透性增高中起着主要的信号转导作用.该文主要研究Rho家族中Racl蛋白在血管EC形态和通透性变化中的作用,试图阐明Racl是否为调节EC肌动蛋白细胞骨架改变的重要信号分子,及其在炎症介质介导的EC单层通透性增高中的信号转导作用.方法:(1)根据Genebank hPBD mRNA序列,设计合成引物,从EC mRNA中克隆与Racl和Cdc42相结合的人PAK1结合域(human p21 binding domain,hPBD),将其插入GST融合蛋白表达质粒,转化BL21宿主菌,表达与Racl/Cdc42相结合的GST-hPBD融合蛋白,经亲和层析纯化后,用于pull down实验,测定EC中活化的Racl蛋白含量.(2)应用pull down分析检测TNF-α和LPS刺激前后EC中Racl蛋白的活化表达,应用Rhodamine-Phalloidin染色,荧光显微镜下观察EC骨架重排.以HRP为示踪剂测定刺激前后EC通透性的改变.通过上述工作探讨EC Racl活性的变化与细胞肌动蛋白骨架、细胞间隙和内皮单层通透性改变的关系.结论:hPBD原核表达载体的成功构建及融合蛋白的表达纯化,为我们进一步探讨Rho GTPases的活性改变提供了一个良好的实验方法和实验基础.同时,细胞因子TNF-α和炎症介质LPS刺激引起的细胞内皮通透性改变和细胞内骨架重排,与细胞内活化Racl蛋白的增加在时相上密切相关,提示Racl蛋白可能在肌动蛋白骨架及细胞间隙改变和内皮单层通透性的增高中起着信号转导作用.

目录

前言

实验材料

实验方法

第一部分人融合蛋白GST-HPBD原核表达载体的构建、纯化及活性测定

结果

讨论

第二部分RAC1蛋白与血管内皮通透性及细胞骨架变化相关关系的研究

结果

讨论

结论

参考文献

综述RHO GTPASES与细胞信号转导

参考文献

致谢

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