质粒介导RNA干扰靶向hTERT抑制K562细胞端粒酶活性的研究

摘要

本实验以hTERT为作用靶点，运用RNAi技术，将能表达hTERT-siRNA的质粒载体转染K562细胞，旨在探索有效降解hTERTmRNA、抑制端粒酶活性的siRNA序列，观察质粒载体诱导RNAi维持目的基因沉默的持续时间，为RNAi技术在端粒酶抑制剂和肿瘤治疗方面的应用进行实验研究。 研究方法： (1)根据端粒酶hTERT基因序列依据siRNA设计原则，设计合成三条21bp的siRNA链，转染K562细胞观察hTERT抑制效应，根据结果选取两条能高效特异抑制目的基因hTERTmRNA表达的siRNA链，然后分别设计合成2对65nt的寡核苷酸(shDNA)用以构建表达载体，shDNA基本结构为：BamHISense+Loop+Antisense+终止信号(TTTTTT)+SalⅠ+HindⅡ，将互补的两条单链寡核苷酸退火连接到质粒载体中，经酶切结果鉴定是否成功构建。 (2)以人红白血病细胞株k562为实验对象，实验分五组：空白对照组、pGC-hTERT-1、pGC-hTERT-2、阴性对照组、阳性对照组(pGC-GAPDH)。 (3)选取生长健康处于分裂增殖期的细胞，调整细胞密度为(0.5-1)×106/ml，以阳离子脂质体为转染试剂，对各组质粒载体进行转染，作用48h和72h后收集细胞，用荧光显微镜和流式细胞仪观察各作用组细胞的转染率，然后用含G418的培养液对各作用组的细胞进行筛选，直至空白对照组的细胞全部杀死，收集其它作用组细胞进行结果测定。 (4)分别用RT-PCR检测靶基因hTERTmRNA和GAPDH基因的表达情况、PCR-ELISA法检测细胞的端粒酶活性，流式细胞仪检测各作用组细胞凋亡率。 研究结果： (1)三条化学合成的siRNA链中，有两条siRNA-1和siRNA-2在48h能明显抑制hTERTmRNA的表达，抑制率分别为85﹪和45﹪，故选此二链构建siRNA表达载体。 (2)质粒载体插入目的基因片段之后，PstⅠ酶切位点被取代，故不能被PstⅠ所酶切，插入的目的基因片段里设计了一个SalⅠ的酶切位点，故能被SalⅠ酶切出一条约400bp的DNA片断，凝胶电泳图谱均显示有一条约400bp的DNA片断，故质粒载体构建成功。 (3)细胞转染48h后荧光显微镜显示各作用组细胞中均有绿色荧光蛋白，质粒载体转染成功，同时流式细胞仪检测细胞转染率为pGC-hTERT-1组5.74﹪，pGC-hTERT-2组5.66﹪，阴性对照组7.5﹪，pGC-GAPDH组4.31﹪。 (4)细胞在G418培养液中培养5天后，空白对照组的细胞全部死亡，收集筛选后的K562细胞进行结果检测。 (5)RT-PCR结果显示，阳性对照组(pGC-GAPDH)的GAPDHmRNA表达较1-4组明显下调，与阴性对照组相比pGC-hTERT--1组pGC-hTERT-2组在48h和72hhTERTmRNA的表达都下调，且以pGC-hTERT-1组的作用更加明显。 (6)端粒酶活性pGC-hTERT-1作用组48h(0.552±0.031)72h(0.382±0.11)、pGC-hTERT-2作用组48h(0.61±0.042)72h(0.52±0.72)与阴性对照组(0.786±0.314)相比有统计学意义(P＜0.05)。 (7)细胞凋亡率pGC-hTERT-1组48h(14.33±1.16﹪)pGC-hTERT-2组48h(10.41±1.26﹪)与阴性对照组(7.64±0.484﹪)相比有显著性差异(P＜0.05)，72h细胞凋亡率渐下降pGC-hTERT-1组(10.02±0.85﹪)pGC-hTERT-2组(6.77±1.24﹪)而阴性对照组(8.07±0.166﹪)较48h升高，二者比较无统计学差异。 研究结论： (1)化学合成的siRNA-1和siRNA-2链能以一定的序列特异性高效抑制hTERTmRNA表达，抑制率分别为85﹪和45﹪。 (2)在阳离子脂质体作用下质粒载体能成功转染到K562细胞中，转染率分别为5.74﹪、5.66﹪、7.5﹪、4.31﹪。 (3)阳性对照组(pGC-GAPDH)能明显抑制GAPDHmRNA的表达，表明该质粒载体介导RNAi的有效性，靶向hTERT的质粒载体能够明显下调K562细胞hTERTmRNA的表达，并表现出一定的序列特异性。 (4)该质粒载体介导的RNAi能够抑制K562细胞端粒酶活性，抑制时间能达到一周甚至更长。 (5)48h时各质粒载体作用组较阴性对照组能明显增加细胞凋亡率，但随着时间的延长细胞凋亡率渐下降。总之，质粒载体介导的RNAi能特异性的下调K562细胞hTERTmRNA的表达，抑制端粒酶活性，产生相应的功能缺失，同时诱导细胞凋亡。

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结果

讨论

结论

参考文献

综述端粒酶相关的肿瘤治疗新进展

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